提RNA逆转录qRTCR步骤

1、【一、提RNA一、实验准备：1、试剂：75充醇、Trizol、 进口 EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头（RNA专用）、2、配75%醇（DEPC水+无水乙醇），放-20 C冰箱预冷；3、预冷离心机 EP管用的）；4、清洁桌面，酒精喷过之后擦干，新手套、两层口罩；二、操作步骤：01、弃上清（不回收，直接倒去）；02、1mL/孔PBS洗两遍（不回收，直接倒去，随后用 200 dL枪吸尽PBS ;03、每孔加500 dL Trizol ,轻晃，随后室温放置 2min左右；04、枪头吹打，吸出放入 进口 EP管；05、加入100 dL氯仿（即1/5体积的trizol）;06、4 c 离心机，12000g,

2、 15min；07、吸200 dL（可减少）上清放入新的 进口 EP管中（注意：只能吸到上清）；08、加入等体积异丙醇，充分混匀，常温放置10-30min（15min）;09、4 c 离心机，12000g, 10min；10、倒掉液体，加入 1mL预冷的75充醇剧烈混匀；11、4 c 离心机，7500g, 5min；12、倒掉上清，加入 1mL预冷的75充醇，混匀；13、4 c 离心机，7500g, 5min；14、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10min ,用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠；15、每管中加入 40 d L（40科-60WL）的DEPOK,吹打溶解；16、测浓度（先知楼

3、 21楼测RNA浓度，带DEPCK、灭菌的dd水、10微升枪和枪头）；三、注意事项01、如果当时不测 RNA浓度，可暂时把 RNA放在-20 C冰箱。但长时间（24h）保存，需要放在-80 C冰箱；02、异丙醇作用是沉淀 RNA作用比乙醇好；03、04、05、06、07、08、09、【二、测RN雁度】一、实验准备：01、先知楼21楼-2109教室，一个冰盒 +DEPOK + 10微升枪、灭菌 dd H2。10dL枪头（RNA 专用）、本子+笔；二、操作步骤：01、登记；02、打开电脑=打开"N"软件=点击"Nucleic acid "=选择"O

4、K =选择"RNA ; 03、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；04、DEPOK校零：即力口 DEPCK一滴，点击“ Blank”，擦干；05、测RNA加样品一滴，点击“measure”,擦干，随后加下一个样品；06、记录数据，包括 RNA浓度（1000ng/科L）、260/280 ;07、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；08、-80 C冰箱 保存； 三、注意事项230nm代表水平（），260nm代表RNA水平，280nm代表蛋白水平，260/230表示有机物量， 260/280 代表 RNAI取量；是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为。如果不在此范围，稀释或浓缩样品

5、，使 之在此范围内；如果吸光度小于，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等） 影响。DNA样品的A260吸光度值是否 。（请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大 于，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收， 其值）；、A270nm是最高吸收峰的吸收波长，比值可进行样品纯度评估：纯 DNA的A260/A280比值为， 纯RNA为。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=相当于50%/DNA溶液.酚的最大吸收峰在 270nm。3. A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯D

6、NA和RNA的A260/A230比值为。若比值小于 标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需 要纯化本¥品。A230产生负值主要是由于在很低DNA浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正。？4. A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近。如果不是，标明 溶液中有悬浮物，需要样品。纯样品的A320 一般是0。?5. A260/A280 和A260/A230 是纯度的指示值。纯度好的DNAgg RNA在 下A260 / A280 的比值应该在 或。纯净的样品比值大于（ DNA或者（

7、RNA o如果比值低于 或者，表示存在蛋白质 或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如、盐（服盐）等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于。当% BSA污染时，蛋白污染会导致260和280的数值都下降，其净结果是260/280比值下降，但 260/280的比值变化并不显着，正如克隆 3所说。但蛋白残留会导致 230的数值显着上升，显着影响260/230的比值。也就是说，如果RNA样品的260/280 =, 260 /230 =，那么就应该考虑污染原因不是服盐残留，而是蛋白残留.用测量RNA时，用水而不是用 TE缓冲液稀释 RNA样品会造成 A260/A280比值下降。原因是

8、低离子强度和低pH溶液会增加280 nm处的光吸收值。加氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多，那样就很容易被蛋白污染，所以现在一般取400ul左右。？6. 当260/2301时，只有两种情况。一是月瓜盐污染，二是污染。【三、逆转录】一、实验准备：01、进口 10 dL枪头（qRT-PCR专用）、冰盒一个、200 dL进口 EP管；02、冰上融化1、2、4、2号试剂（提前半小时）；03、二、操作步骤：试剂盒：1.2 L2. L（最后加入）3. l L4. 科LRNA 1000ngDEPC 水10L体系01、200 dL进口管子：EP管加相应 DEPC水=力口 1号试齐IJ （ 2WL）=加3号试齐

9、l L）=力口 4号试齐IL）=力口 2号试齐IL）=力口 RNA=离心=上机；02、上机：OPEN=点击"User"菜单下的"clx ",点击"Accept"=选择"run"下面的 至ij " exp001 rt "=啰改体系"10!iL”（默认为25微升）= 点击"Start ”,进入界面； 03、C 15min= C 5s= C 60min ;04、4 c冰箱保存；三、注意事项01、加液尽量无气泡，枪不要打到底；02、严格冰上操作，防止RNAW解；【qRT-PCR一、实

10、验准备:01、试齐【J: Roche 的 SyBr Green(rox)02、EP 管、EP 管、96 孔板/八连冠；10 科1_、20 科1_、100 科1_、200 科 L、科 L、1000 dL 枪;03、冰盒一个、 Rox化冻(避光)、引物化冻(GAPDH、cDNA DEPOK;二、操作步骤：01、 Rox 10(1 L;+ dd H 2O 6 L;+ P1(F) 1+ P2(R) 1+ cDNA 220l L体系02、计算：每个样，X个抗体(至少包括GAPDH内参，还有目的)，三个副孔。即如果六个样，2个抗体(GAPDH,PLK1),三个副孔。 6*1*3=18 =20(PLK1),

11、6*1*3=18 =20(GAPDH);1234567891011126/ PLK16/ PLK16/ PLK15/ PLK15/ PLK15/ PLK16/GAP6/GAP6/GAP5/gap5/gap5/gap4/ PLK14/ PLK14/ PLK13/ PLK13/ PLK13/ PLK12/ PLK12/ PLK12/ PLK11/ PLK11/ PLK11/ PLK14/gap4/gap4/gap3/gap3/gap3/gap2/gap2/gap2/gap1 /GAP1 /GAP1 /GAPPLK1Rox : 10*20=200 LDEPC 水：6*20=120 科 LF: 1*2

12、0=20 LR: 1*20=20 LGAPDHRox : 10*20=200 LDEPC 水：6*20=120 科 LF: 1*20=20 LR: 1*20=20 L03、稀释 cDNA 10 倍(18L DEPC水+2 L)=> 配置 Mix(Rox+ DEPC 水+F+R)=>加中¥ (一横排先加 18 dL mix(GAPDH),随后加入 18 dL mix(PLK1)。随后六个孔加同一个cDNA06、去除气泡：加好样后，观察有无气泡。如果有气泡，弹开，随后 >2000rpm离心，时间 不定(5s即可)； 07、上机+ 设置程序：A 、双击打开程序 "

13、;StepOne Software "=>点击"OK "=>点击"Ignore & Continue Startup "=>点击" Advanced Setup " =>2入" Experment Properties 界面 ”;B> Experment Properties 界面：将 Expriment Name 从 Untitled 修改为"日期，如 2015-12-17 ",将 User Name(Optional)修改为"CZL;Which

14、 instrument are you using to run the experiment ? 中选择 "96 wells ", 一般无需修改；What type of experimentdo you want to setup ?中选择“Quantitation-Comparative Ct( Cr)"Which reagents do you want to use to detect the target sequence ?中选择“SYBR Green Reagents "Which ramp speed do you want to us

15、e in the instrument run ? 中选择 "Fast( 40 minutes to complete a run) ”;C Plate Setup 界面-Define Targets and Samples 界面：Define Targets 栏中：如果有 GAPDHPLK1、Akt、PI3K 三个引物，则点击 “ Add New Target ”三下，出现"Targetl、Target2、Target3、Target4 "三个=将其重命名；Define Samples 栏中：如果有 6 个样品(N;3;6;9;12) ，则点击“Add New

16、Sample ", 出现"Sample 1、Sample 2、Sample 3、Sample 4、Sample 5、Sample 6 "六个=将其重 命名；系列之Plate Setup 界面-Assign Targets and Samples 界面：GA四GAP1GAP1GAP2GAP2GAP2GAP3GAP3GAP3GAP4GAP4GAP4Plk1 /1Plk1 /1Plk1 /1Plk1 /2Plk1 /2Plk1 /2Plk1 /3Plk1 /3Plk1 /3Plk1 /4Plk1 /4Plk1 /4Akt/1Akt/1Akt/1Akt/2Akt/2Akt/2Akt/3Akt/3Akt/3Akt/4Akt/4Akt/4PI3K/1PI3K/1PI3K/1PI3K/2PI3K/2PI3K/2PI3K/3PI3K/3PI3K/3PI3K/4PI3K/4PI3K/4GAP5GAP5GAP5GAP6GAP6GAP6Plk1 /5Plk1 /5Plk1 /5Plk1 /6Plk1 /6Plk1 /6Akt/5Akt/