5-第五章--基因的克隆与分离

1、第一节第一节PCRPCR扩增获得目的基因或扩增获得目的基因或cDNAcDNA第二节基因组文库的构建与基因分离第二节基因组文库的构建与基因分离第三节第三节cDNAcDNA文库的构建与筛选文库的构建与筛选第四节根据差异表达获得目的基因第四节根据差异表达获得目的基因第五节基因的化学合成第五节基因的化学合成一、一、cDNA末端的快速扩增（末端的快速扩增（RACE）RACE：根据已得到的不完整的：根据已得到的不完整的cDNA序列设计引序列设计引物对物对mRNA3端和端和5端进行克隆，可获得端进行克隆，可获得全的全的cDNA克隆克隆 。（。（RACE克隆的意义）克隆的意义）1、根据基因编码蛋白同源序列，或

2、多个同源基因、根据基因编码蛋白同源序列，或多个同源基因cDNA序序列设计（简并）引物，列设计（简并）引物，RT-PCR克隆核心序列克隆核心序列，测序。，测序。 2、根据核心序列，设计新的引物进行、根据核心序列，设计新的引物进行cDNA的的3端和端和5端端的扩增的扩增。3、拼接拼接成成 cDNA全序列的信息，设计新的引物全序列的信息，设计新的引物扩增全长扩增全长cDNA序列。序列。一、一、cDNA末端的快速扩增（末端的快速扩增（RACE）（二）经典（二）经典RACE克隆原理：克隆原理： 3 RACE：由含有：由含有oligo（dT）的接头引物引发）的接头引物引发合成合成cDNA第一链，根据中间核

3、心序列设计出上游引第一链，根据中间核心序列设计出上游引物，与物，与3引物扩增第一链引物扩增第一链cDNA，可得到全长，可得到全长cDNA的的3末端序列。末端序列。 5 RACE：先用：先用oligo（dT）引发合成）引发合成cDNA第第一链，然后在第一链一链，然后在第一链cDNA的的3端加上人工锚定序列，端加上人工锚定序列，利用利用5锚定引物及锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的的5末端序列。末端序列。由含有由含有oligo（dT）的接头引物引发合成第一链）的接头引物引发合成第一链cDNA根据中间核心序列设计出根据中间核心序列设计出5特异性引物特异性引

4、物与与3引物扩增第一链引物扩增第一链cDNA5RACE在第一链在第一链cDNA的的3端加上人工锚定序列端加上人工锚定序列用用oligo（dT）引发合成）引发合成cDNA第一链第一链 利用利用5锚定引物及锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的的5末端序列末端序列 基因组文库：将某一生物基因组基因组文库：将某一生物基因组DNA片段化并全片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的些重组载体上带有了该生物体的全部基因全部基因。操作：将某种生物细胞的操作：将某种生物细胞的整个基因

5、组整个基因组DNA切割成切割成大小合适的片断，并将大小合适的片断，并将所有这些片断所有这些片断都与适当的载体都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增保存和扩增。一、基因组文库（一、基因组文库（genomic library）（2）目前常用的载体）目前常用的载体 二、二、 构建基因文库的载体选用构建基因文库的载体选用载体能够容载的载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的整的基因文库所需要的重组子重组子的数目。的数目。载体容量越大，所要求的载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所片断数目越少，所需的需的重组子重

6、组子越少。越少。（1）对载体的要求）对载体的要求 载体系列：载体系列： 容量为容量为 23 kp cosmid载体：载体： 容量为容量为 45 kb YAC： 容量为容量为 1 Mb BAC: 容量为容量为 300 kb1、文库的完整性：、文库的完整性：文库应包含基因组的完整序列信息文库应包含基因组的完整序列信息2、基因组信息的可重建性：、基因组信息的可重建性：重建基因组的完整信息重建基因组的完整信息3、文库的大小：、文库的大小：即文库中应包含的独立重组子数目即文库中应包含的独立重组子数目三、基因组文库应满足的条件三、基因组文库应满足的条件文库的大小：文库的大小：一个文库要包含一个文库要包含9

7、9%的基因组的基因组DNA时所需要的克隆数目。时所需要的克隆数目。N=ln (1-P)ln (1-L/G)P：文库包含了整个基因组：文库包含了整个基因组DNA的概率（的概率（99%）L：克隆：克隆fragment的平均大小的平均大小G：Genome大小大小N：所需的重组载体数（克隆数）：所需的重组载体数（克隆数）N=4.61GL例如：人的基因组是例如：人的基因组是 3109 bp，插入，插入DNA片断片断的平均长度如果是的平均长度如果是1.7104 bp，所需的重所需的重组载体数：组载体数：N=基因组文库实际克隆数：比计算值大基因组文库实际克隆数：比计算值大2倍或倍或3倍，或更高倍，或更高4.

8、61Gf=4.6131091.7104= 8.1105四、基因组文库构建的一般步骤四、基因组文库构建的一般步骤1、染色体、染色体DNA的分离的分离2、大片段的制备、大片段的制备3、载体的制备、载体的制备2、大片段的制备、大片段的制备小孔喷射（小孔喷射（10kb）、超声波（）、超声波（300bp）、机械搅拌（）、机械搅拌（8kb） 酶切法：酶切法：不完全酶解：产生随机性的不完全酶解：产生随机性的DNA片段，片段大小取决于片段，片段大小取决于内切酶识别的位点数和酶解程度。内切酶识别的位点数和酶解程度。识别识别4对碱基的内切酶适用于制备对碱基的内切酶适用于制备120kb的的DNA片段片段 物理切割法

9、：物理切割法：1、染色体、染色体DNA的分离的分离如：如：Sau3A与与BamHI的酶切末端。的酶切末端。p1083、载体的制备、载体的制备内切酶，将内切酶，将 载体切成三段：载体切成三段：左臂、右臂、中间片段左臂、右臂、中间片段左臂左臂可置换区可置换区右臂右臂Sal IBamH I EcoR IEcoR IBamH I Sal I20kb14kb9kb4、重组连接、重组连接左臂左臂插入片段插入片段右臂右臂左臂左臂插入片段插入片段插入片段插入片段右臂右臂5、包装、包装6、重组噬菌体、重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 基因组文库基因组文库 五、基因组文库的筛选五、基因组文库的筛选筛选：从众多的

10、分子克隆群体中将确定的克隆筛选出筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出来来探针筛选法：探针筛选法：两步或三步原位杂交法两步或三步原位杂交法以以mRNA为模板为模板逆转录逆转录出的出的DNA称称cDNA。cDNA librarymRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶反转录酶引物引物将某一生物的将某一生物的特定组织特定组织或或特定发育时期特定发育时期细胞内的全部细胞内的全部mRNA反转录成反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段则每个细菌含有一段cDNA，这些，这些cDNA克隆（包含着细胞全克隆（包含着细胞全部部mRNA信息）的集合

11、称为信息）的集合称为该组织细胞该组织细胞的的cDNA文库。文库。一、一、 cDNA文库的特点文库的特点cDNA二、二、 构建构建cDNA文库的一般步骤文库的一般步骤（1）总）总RNA（total RNA）提取）提取Trizol试剂提取，或商业化的试剂盒（试剂提取，或商业化的试剂盒（kit）。）。（2）mRNA的分离纯化的分离纯化分离分离mRNA用商业化的用商业化的Oligo dT纤维柱。纤维柱。 反转录酶反转录酶（3）cDNA的合成的合成 cDNA第一链合成第一链合成逆转录酶能以逆转录酶能以RNA为模板合成为模板合成DNA。 用用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成（或随机引物）作引物，

12、合成cDNA的第一链。的第一链。 mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物引物用用RNase H识别识别mRNA-cDNA杂交分子中的杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。并将其降解成许多小片断。mRNAcDNA第一链第一链3 3 5 5 引物引物cDNA第一链第一链3 5 引物引物 降解降解mRNA模板模板RNaseHmRNAmRNAmRNA cDNA第二链合成第二链合成mRNA小片断为引物，合成第二链小片断为引物，合成第二链cDNA。DNA Pol I除去引物并修补后，再使用除去引物并修补后，再使用DNA连接酶连接酶连成一整条连成一整条DNA链。

13、链。mRNAcDNA第一链第一链3 5 mRNAmRNADNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶cDNA第二链第二链cDNA第一链第一链3 5 DNA ligase去引物去引物在双链在双链cDNA末端接上末端接上人工接头人工接头（含限制性内切（含限制性内切酶黏性末端），即可与载体连接，转入受体菌。酶黏性末端），即可与载体连接，转入受体菌。 或借助或借助末端转移酶末端转移酶给载体和双链给载体和双链cDNA的的3端分端分别加上几个别加上几个C或或G，成为粘性末端。，成为粘性末端。（4）cDNA与载体连接与载体连接接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶（5）重组载体

14、转化受体菌）重组载体转化受体菌分子探针杂交法分子探针杂交法：用目的基因探针与文库中的重组载：用目的基因探针与文库中的重组载体进行体进行Southern blot杂交杂交。文库文库载体载体探针探针电泳后杂交电泳后杂交放射自显影放射自显影测序分析测序分析三、文库的查询（三、文库的查询（screening） 基因组文库克隆的是基因组文库克隆的是任何片段任何片段，包括未知功能的，包括未知功能的DNADNA序列、调控基因，序列、调控基因，cDNAcDNA文库克隆的是具有蛋白文库克隆的是具有蛋白质产物的质产物的结构基因结构基因。 基因组文库克隆的是基因组文库克隆的是全部遗传信息全部遗传信息，不受时空影，不

15、受时空影响；响；cDNAcDNA文库克隆的是不完全的编码文库克隆的是不完全的编码DNADNA序列，序列，受受发育的调控因子的影响发育的调控因子的影响。 基因组文库中编码基因是真实的基因，基因组文库中编码基因是真实的基因，含有内含含有内含子子和外显子；和外显子；cDNAcDNA克隆的是克隆的是不含内含子不含内含子的基因。的基因。G Genomicenomic library library与与cDNAcDNA library library区别区别一、一、cDNA末端的快速扩增（末端的快速扩增（RACE）根据已得到的不完整的根据已得到的不完整的cDNA序列设计引物对序列设计引物对mRNA3端和端

16、和5端进行克隆，可获得全的端进行克隆，可获得全的cDNA克克隆隆 。（。（RACE克隆的意义）克隆的意义）上节内容回顾上节内容回顾（二）经典（二）经典RACE克隆原理：克隆原理：（一）（一）RACE：由含有由含有oligo（dT）的接头引物引发合成第一链）的接头引物引发合成第一链cDNA根据中间核心序列设计出根据中间核心序列设计出5特异性引物特异性引物与与3引物扩增第一链引物扩增第一链cDNA5RACE在第一链在第一链cDNA的的3端加上人工锚定序列端加上人工锚定序列用用oligo（dT）引发合成）引发合成cDNA第一链第一链 利用利用5锚定引物及锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长特异性

17、引物进行扩增，得到全长cDNA的的5末端序列末端序列 二、基因组文库的构建与基因分离二、基因组文库的构建与基因分离基因组文库：将某一生物基因组基因组文库：将某一生物基因组DNA片段化并全片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的些重组载体上带有了该生物体的全部基因全部基因。（一）基因组文库（一）基因组文库（genomic library）（二）基因组文库应满足的条件（二）基因组文库应满足的条件1、文库的完整性、文库的完整性2、基因组信息的可重建性、基因组信息的可重建性3、文库的大小、文库的大小（三）基因组文库

18、构建的一般步骤（三）基因组文库构建的一般步骤1、染色体、染色体DNA的分离的分离2、大片段的制备、大片段的制备3、载体的制备、载体的制备（四）基因组文库的筛选（四）基因组文库的筛选筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出来来探针筛选法：探针筛选法：两步或三步原位杂交法两步或三步原位杂交法（一）（一）cDNA library将某一生物的将某一生物的特定组织特定组织或或特定发育时期特定发育时期细胞内的全部细胞内的全部mRNA反转录成反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段则每个细菌含有一段c

19、DNA，这些，这些cDNA克隆（包含着细胞全克隆（包含着细胞全部部mRNA信息）的集合称为信息）的集合称为该组织细胞该组织细胞的的cDNA文库。文库。三、三、cDNA文库的构建与筛选文库的构建与筛选（二）（二）cDNA文库应满足的条件文库应满足的条件（三）（三） 构建构建cDNA文库的一般步骤文库的一般步骤（1）总）总RNA（total RNA）提取）提取（2）mRNA的分离纯化的分离纯化（3）cDNA的合成的合成（4）cDNA与载体连接与载体连接（5）重组载体转化受体菌）重组载体转化受体菌 基因组文库克隆的是基因组文库克隆的是任何片段任何片段，包括未知功能的，包括未知功能的DNADNA序列、

20、调控基因，序列、调控基因，cDNAcDNA文库克隆的是具有蛋白文库克隆的是具有蛋白质产物的质产物的结构基因结构基因。 基因组文库克隆的是基因组文库克隆的是全部遗传信息全部遗传信息，不受时空影，不受时空影响；响；cDNAcDNA文库克隆的是不完全的编码文库克隆的是不完全的编码DNADNA序列，序列，受受发育的调控因子的影响发育的调控因子的影响。 基因组文库中编码基因是真实的基因，基因组文库中编码基因是真实的基因，含有内含含有内含子子和外显子；和外显子；cDNAcDNA克隆的是克隆的是不含内含子不含内含子的基因。的基因。Genomic Genomic librarylibrary与与cDNAcDN

21、A library library区别区别第四节 基因差异表达获得目的基因一、一、 差异显示差异显示PCR（DDRT-PCR）（1）3 锚定引物锚定引物Oligo（dTMN）：）：Oligo（dT）引）引物的物的3端加两个核苷酸（倒数第二端加两个核苷酸（倒数第二个不再是个不再是T）。）。 AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NM TTTTTTTTM：A、G or C N: A、G、T or C5 3 利用利用mRNA的的poly A尾巴设计尾巴设计 利用利用两组特殊的引物两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增对差别表达的基因进行扩增12种锚定引物种锚定引物AG TTTTTTTT5

22、3 CG TTTTTTTT5 3 GG TTTTTTTT5 3 TG TTTTTTTT5 3 AA TTTTTTTT5 3 CA TTTTTTTT5 3 GA TTTTTTTT5 3 TA TTTTTTTT5 3 AC TTTTTTTT5 3 CC TTTTTTTT5 3 GC TTTTTTTT5 3 TC TTTTTTTT5 3 （2）5端的随机引物端的随机引物 AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NM TTTTTTTT5 3 RTNM TTTTTTTT 5 cDNA 3 NNNNNNNNNN5 3 cDNA第二链，并第二链，并PCR（3）用一种）用一种3锚定引物和一种锚定引物和

23、一种5随机引物进行扩增随机引物进行扩增12种锚定引物，若与种锚定引物，若与20种随机引物，可组成种随机引物，可组成240组引物。组引物。引物组合：引物组合：实验结果：实验结果：如果每条带相当于一种如果每条带相当于一种mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。在测序胶上，每组扩出在测序胶上，每组扩出50-100条长度为条长度为100-500bp的带。的带。240组能分出组能分出20000多条带！多条带！（4）随机）随机-锚定引物锚定引物PCR的产物电泳比较的产物电泳比较相同引物对在不同来源相同引物对在不同来源cDNA中的中的PCR产物

24、并排电泳产物并排电泳选择有差异的带，回收测序，得到部分选择有差异的带，回收测序，得到部分cDNA序列。序列。再通过筛选文库等各种方法获得全长再通过筛选文库等各种方法获得全长cDNA或基因。或基因。优点：优点：速度快、操作简单、灵敏度高、样品需要量少等；速度快、操作简单、灵敏度高、样品需要量少等；缺点：缺点：假阳性率高、获得的假阳性率高、获得的cDNAcDNA片段很短。片段很短。1976年年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的提出了用化学方法合成基因的设想，并于设想，并于1979年在年在science上发表了率先成功地合上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。基因的论文。第五节第五节 基因的化学合成基因的化学合成一、化学合成目前常用的方法一、化学合成目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸二酯法、磷酸三酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、固相合成法、自动化合成法。自动化合成法。1、互补延伸连接法、互补延伸连接法二、化学合成二、化学合成DNA片断的组装片断的组装预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片