分析方法验证(13-10-25)

1、分析测试中心 陈晓丽2013.10.25分析方法验证分析方法验证一、概述1、分析方法验证的定义： 分析方法验证是证明一个分析方法适合于特定产品的某种分析需要的过程。2、验证的目的： 为了得到准确、精密、可靠的数据。分析方法验证分析方法验证3、分析方法验证相关的常用指导原则 各国药典附录： 如USP1225方法验证，中国药典 2010 年版二部附录 XIX A药品质量标准分析方法 验证指导原则。 FDA：分析方法验证指南 SFDA：化学药物质量控制分析方法验证技术 指导原则 ICH：Q2（R1）分析方法验证4、适用范围： 新建立的分析方法； 分析方法出现变更时； 采用药典及其它法定标准未收载的分

2、析方法； 药品生产工艺变更，可能引入新的杂质时。5、不适用范围： 对于仅需按照实验室日常测试操作步骤即可测定的分析项目不需要进行验证，如外观、崩解时限、密度、重量、pH值、干燥失重、灰分、装量等等。 二、分析方法验证过程1、准备工作： 人： 有可以运用该分析方法，经过培训的人员。 仪器： 有符合要求的、经过校准的、稳定的仪器。 验证方案： 有经过批准的该待验证分析方法的验证方案，其中有明确的职责规定，对于每一个步骤都有详细的描述，对于每一个验证项目都有明确的可接受标准等等 样品 有质量合格的样品，经过准用的合适的各种对照 品。（包括工作对照品、各杂质对照品）2、严格按照批准的验证方案进行验证工

3、作。如 出现异常或需进行适当调整时，应先经过批准。3、验证结束后： 对所得图谱和数据进行分析评价； 得出验证结论，出具验证报告。 三、分析方法验证的内容 根据不同的分析方法的特性及用途确定不同的 验证项目和内容。 下表所列是通常情况下不同类型分析方法应该 进行验证的项目： 1、专属性 专属性是指在其他成分（如杂质、降解物、辅 料等）可能存在的情况下，采用的分析方法能 够正确鉴定、检出被分析物质的特性。 一般方法都应该证明它的专属性。如果一个方 法的专属性不强，应该用其它方法进行补充。 证明专属性的方式有3种：（1）在杂质可以得到的情况下，向样品中加入 一定量的杂质，证明杂质与样品能够得到分 离

4、和检出。（2）将样品用强光照射，高温，高湿，酸、碱 水解及氧化的方法进行破坏，比较破坏前后 检出的杂质个数和量。 （3）在杂质或降解产物不能获得的情况下，可 以通过与另一种已证明合理但分离或检测原 理不同、或具较强分辨能力的方法进行结果 比较来确定。2、系统精密度 系统精密度是指同一个样品溶液在连续进样的 情况下获得的结果之间的接近程度。 目的：证明在该分析方法的运用上当天仪器的 性能。（这也常是系统适应性的要求之一） 一般情况下，本项验证采用的样品溶液会是 100%的杂质加标样品溶液。 采用连续进样6针后得到的各杂质及样品的峰 面积的RSD作为评价标准。3、方法精密度 方法精密度是指在同样的

5、操作条件下，在较短 的时间间隔内，对同一批样品，由同一分析人员称取数份样品，平行测定所得结果之间的接近程度。 证明方法精密度的方式有两种： （1）制备6份100浓度的试样，用各自测得的结果进行评价； （2）制备3个不同浓度的试样，用各测定3次的 结果进行评价 。 我们常用的是第1种方式。 对测得的各份结果用RSD来评价。杂质一般可 接受标准为10.0%，含量一般可接受标准为 2.0%（基本上和系统适应性中要求一致）4、中间精密度 中间精密度是指在同一实验室，由于实验室内 部条件改变时测定结果的接近程度。 验证设计方案中的变动因素一般为日期、分析 人员、设备。 中间精密度的验证方式及评价标准和方

6、法精密 度完全相同。 方法精密度和中间精密度的结果之间也要有一 个评价标准： （1）各自测得结果之间的绝对差值应符合要求，比如:含量差值1.0%，杂质差值0.05%，残留溶剂差值（浓度的25%）等。 （2）所有结果的RSD应符合要求（与方法精密度的要求基本一致）。5、检测限和定量限 检测限是指样品中的被分析物能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量。检测限是为了考察分析方法是否具备灵敏的检测能力。 定量限是指样品中的被分析物能够被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。 当用 GC 和 HPLC 法时 ，一般以信噪比为3： 1时的

7、相应浓度作为检测限，以信噪比为10：1 时的相应浓度作为定量限。 其它方法：也可以用工作曲线的斜率和响应的 标准偏差进行计算的方法得到检测限和定量限。 6、线性和范围 线性是指在设计的测定范围内，检测结果与样 品中被分析物的浓度（量）直接呈线性关系的 程度。 范围是指能达到一定精密度、准确度和线性， 测试方法适用的高低限浓度或量的区间。 线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项 目，如杂质定量试验和含量测定均需验证线性。 验证方式：可用一贮备液经精密稀释，或分别 精密称样，制备一系列被测物质浓度系列进行 测定，至少制备5个浓度。以测得的响应信号 （如峰面积、吸光值等）作为被测物浓度的函数 作图，

8、观察是否呈线性，计算线性回归方程。 线性验证范围： 含量：80120% 杂质：LOQ 150% 评价标准：相关系数R。 如HPLC、GC色谱法： 含量线性，R0.999 杂质线性，R0.9957、准确度 准确度是指用该分析方法测得的结果与真实值 或认可的参考值之间接近的程度。 用于定量测定的分析方法均需做准确度验证。 证明方式： 制备3个不同浓度的样品溶液，各测定3次，即 测定9次。 （ 也可以3个浓度，每个浓度配制3份样品） 一般用已知加入量的被分析物的回收率 ( ) 作为评价标准 。 含量的回收率要求：98102%； 杂质的回收率要求：80120%； 各份样品测得回收率的RSD10.0%

9、准确度和精密度的作用不同。8、耐用性 耐用性是指测定条件发生小的变动时，测定结 果不受影响的承受程度。 耐用性主要考察方法本身对于可变试验因素的 抗干扰能力，为使方法用于常规检测提供依据。 经耐用性试验证明，如果测试条件要求苛刻， 则应在方法中写明。 典型的变动因素有：被测溶液的稳定性等。液相色谱法：流动相的组成比例或 pH 值，不 同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温，流 速及检测波长等。气相色谱法：不同厂牌或批号的色谱柱、柱温， 进样口和检测器温度等。薄层色谱法：不同厂牌的薄层板，薄层展开时 温度及相对湿度的变化等 溶液稳定性 （1）用来证明根据相应方法制备的样品溶液和标准品溶液在规定的储

10、存条件下在一定时间内保持稳定。 （2）验证方式： 在规定条件下储存适当的时间间隔后检测。 含量测定：用新鲜配制的标准品溶液测定样品溶液的含量，各时间点测得的RSD应符合要求。 杂质测定：不同时间点测得的峰面积与0时相比较，偏差不得大于5%。（根据杂质大小设定） 以上是一般定量的分析方法在验证过程中都需 要的验证项目。 如果是HPLC、GC方法，则都还应该有系统适 应性要求。 当在两个不同实验室之间已经验证了方法的重 现性时，可以不验证中间精密度。一、概述1、分析方法确认的目的： 证明该分析方法在本实验室条件下的适用性。2、分析方法确认的范围： （1）药典方法； （2)其他法定方法。分析方法确认

11、分析方法确认3、不适用范围 实验室日常测试操作步骤不需要进行方法确认，如干燥失重、炽灼残渣、pH值等等。4、需确认的因素： 人； 设备； 试剂； 其它因素。5、确认方式: 分析方法确认没有固定的方案，需要根据不同的方法来确定需要确认的内容。 如杂质的定量测定方法： 国外：专属性、方法精密度、中间精密度、定量 限、检测限、溶液稳定性。 国内：方式1，由两名实验人员分别对同一批 产品进行检测，比较两人的检测结果。 方式2，确认专属性、精密度、定量限。 强降解试验是指将原料药置于比较强烈的试验条件 下，考察其稳定性的一系列试验。 一般包括酸降解、碱降解、氧化、高温、高湿、光照 六个条件。 在国外，这

12、六个条件都称为强降解试验。 在国内，前三个条件称为强降解试验，后三个则称为影 响因素试验。强降解试验 强降解试验的目的： （1）通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳 定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途 径与降解产物。为初步确定贮存条件提供依 据。 （2）对有关物质分析方法用于检查降解产物 的专属性进行验证。 国内外相关的指导原则，均未对破坏性试验的 具体项目与试验条件作明确的规定。 具体的降解条件： 酸降解： 一般选择0.1N的盐酸 。酸液的浓度、降解的时 间均可根据具体品种，在前期预试验的基础上 灵活确定。 碱降解： 一般选择0.1N的氢氧化钠溶液 。碱液的浓度、 降解的时间均可根据具体

13、品种，在前期预试验 的基础上灵活确定。 氧化降解： 一般采用市售的双氧水 。双氧水的浓度、降解 的时间均可根据具体品种，在前期预试验的基 础上灵活确定。 高温降解： 根据ICH规定，结合中国药典附录要求，我们 一般确定高温条件为：60，放置10天。 高湿降解： 一般采用25 ，RH905%的条件。放置10 天。 一般用饱和硝酸钾溶液制备湿度条件 （ RH92.5% ）。 高湿降解研究时，需要考察样品的吸湿增重， 以确定样品是否具有引湿性，这对于样品包装 的选择非常重要。当吸湿增重5%时，样品具 有一定的吸湿性，需要继续研究。 光照降解： 国内注册要求：4500LX500LX条件下放置 10天。 国外注册要求：放置过程的总照度不得少于 120万LX。 为了同时符合国内外注册的要求，实际操作中将光线照度定为4500LX500LX，放置时间延长到15天。 取样时间点： 酸降解、碱降解、氧化降解根据预试验确定的 时间取样检测。 高温、高湿、光照降解分别于第5、10天取样 检测。（光照降解增加第15天的