W细胞增殖及调控

1、 2.细胞周期的概念： 细胞增殖包括：细胞生长，DNA复制和细胞分裂三个主要事件，构成细胞周期。 可分为四个期：P359 G1期； S期； G2期； M期。 其中的S期是DNA合成期，M期是分裂期，而G1和G2分别是合成前期和合成后期，因为分裂期chr出现明显的形态特征，（通常从一次分裂中期到下一次分裂中期的历程称为一个周期）M期中又分为前期、中期、后期和末期四个阶段。 Eucaryotic Cell Cycle A typical mammalian cell has a cell cycle time of 24 hours, with 12 hr G1, 6-8 hr S, 3-4 hr

2、 G2, and 1 hr M 典型哺乳动物的细胞周期 从细胞增殖行为来看，细胞在晚G1期开始分歧为三类： 周期性细胞即持续在周期中运转的细胞。 Go期细胞（休眠细胞）即暂时脱离周期，但在适当的刺激下仍可恢复进入周期的细胞。P360 终端分化细胞（特化细胞）即不可逆地脱离细胞周期，丧失分裂能力，但保持生理机能活动的细胞。3.细胞周期的速率： 细胞周期时间（Te）是随细胞类型不同而异，周期内四个期的时间亦各不相同，一般规律是： S期长、M期短； G1时间（tG1）易变，但tG2，tS和tM都变化不大；tG1长短是细胞周期速率变化的基础。4.细胞周期各时相的时间确定： 仅M期可依据chr形态变化来

3、判断，其它三期无形态判断依据。 3H-TdR脉冲标记和放射自显影观测： 标记物渗入仅S期细胞，最先在M期出次的标记细胞是被标记的S期最晚期细胞。 细胞周期同步化的人工制备： 生物界有种天然细胞群体呈现自然同步化现象，但一般的体外培养细胞群体皆呈现为非同步化现象，因此细胞生物学研究常需要人工同步化的实验材料。 M期细胞选择收集法 过量TdR双阻断法，（DNA合成抑制剂）此法适用于tGG2（M）tS的细胞类型 分裂中期阻断法5.细胞周期时相及主要事件：（1）细胞周期检验点： 细胞周期沿G1SG2M有序地进行，是与细胞分裂周期有关基因cdc的有序表达结果，而cdc基因的表达效应是受周期中一些检验点（

4、or 称调控点）监控的，以保持严格有序，精确的运转，而不正常的细胞会被阻止在检验点阶段，常说的有G1/ S转换点，G2/M检验点和中期后期转换点等这种特异的监控机构可鉴别细胞周期进程中的错误，并诱导产生特异的抑制因子，阻止细胞周期进一步运行，若这些检验点功能失控，其后果是细胞癌变or 细胞 die。（2）细胞周期各阶段的主要生化活动： 1）G1期：此期细胞内代谢活跃，细胞生长，体积增大，主要进行RNA和蛋白质的合成（重要蛋白质包括：G1周期蛋白质，钙调素及有关DNA合成的酶系等）若G1期的蛋白质及RNA合成受阻，则细胞不能进入S期。2）S期：此期细胞内主要生化事件是DNA合成复制，其次还有组蛋

5、白质，非组蛋白质和RNA的合成，并伴随有核小体结构复制，有三个特点：四种脱氧核苷酸合成速度不均一，S期初期C-G含量高，前后期A-T含量高。ch质复制早晚不同，常ch在S期前半期复制，而异ch质在后半期复制。DNA合成和组蛋白质合成紧密相联，例如：用放线菌酮抑制组蛋白质合成，则DNA合成也马上停止，反之若用羟基尿来阻断DNA合成，组蛋白质也随即停止合成。3）G2期：此期细胞生化活动是为M期的细胞分裂作准备，主要是活跃地合成G2蛋白质，微管蛋白质（形成纺锤丝base），RNA及ATP，这些都是通过G2/M检验点所必需的。4）M期分裂之中，细胞内生化合成活动都减弱，如RNA合成停止，蛋白质合成减少

6、，此期仍有少量非组蛋白质合成。二、有丝分裂：（一）前期 主要事件：染色质凝缩，分裂极的确定，核仁解体和核膜消失。 1）分裂极的确定： 纺锤极决定细胞分裂的方向，而其确定与中心粒活动相关，每个中心体由2个相互垂直排列的中心粒构成，在S期，每个中心粒端部外侧新生一个短的中心粒，与老中心粒垂直分布，到前期，两对中心粒分别移向相对两极，有关中心粒自我装配，生长和转移是周期性规律。（一）前期染色质凝缩，分裂极确立与纺锤体开始形成，核仁解体， 核膜消失。 2）核仁解体： 是由于此期RNA转录停止，原形成的rRNA和rRNP装配成的核糖体unit转移到细胞质中去，而原插入核仁的染色质fibre helix化

7、进入核仁染色体上，所以逐渐缩小消失。 3）核膜消失： 前期末，MPF（ CDK激酶）诱导核纤层蛋白质发生pi化，网络解体而导致核膜破解，核纤层的A和C成为可溶性，而核纤层蛋白质 B附在核膜碎片上，成为小泡分散在细胞质中，而到分裂末期，碎片小泡相互融合重装成核膜，MPF失活导致核纤层蛋白质去pit化，聚成核纤层，恢复完整的核膜结构，前期中MPF导致的下游事件有纺锤体组装，染色质凝聚，核膜和核纤层解体等。 Two centrosomes, and their forming radial arrays of astral microtubules separating on the surface

8、 of an early prophase newt lung cell nucleus. 蝾螈肺细胞在细胞分裂早前期，两个中心粒分开，星形微管在核表面形成放射状排列。 图片来自/（二）中期(metaphase) 此期染色体全部移到赤道板位置排列“染色体列队”，是由于两极对染色体牵引动态平衡所致，在细胞分裂前期，染色体动粒上聚集有Mad和Bnb 蛋白质凡动粒与纺锤体微管联结，其上的Mad和Bnb消失，因而染色体列队完成。图片来自/ 星体微管 着丝点微管 极体微管（二）前中期 核膜解体到染色体排列到赤道面

9、(equatorial plane) 上。（三）中期 染色体排列到赤道面上。（三）后期 (anaphase) 此期主要事件是：染色体着丝粒区纵向断裂，一分为二，两姊妹染色体单体分别趋向两级，其原因是，着丝粒区域在S期chr复制时已奠定了断裂分离的结构基础，到后期时细胞质中Ca2+浓度倍增，诱导了核区域的联接蛋白质解体而出现断裂分离。（四）后期 指姊妹染色体单体分开并移向两极的时期。分为后期A、后期B两个过程。 Anaphase A: separation of the sister chromatids. Anaphase B: separation of the poles. 植物细胞有没有

10、后期B ？Microtubules and Motors in the spindle着丝点微管星体微管极体微管（四）末期(telophase) 此期主要事件是：子核形成和胞质分裂，胞质分裂(Cytokinesis)是指核分解以外的细胞质部分分裂，动物细胞是以中部缢缩方式，而plant 细胞是以形成细胞 壁方式。 后期到末期MPF导致以下事件有：染色体分离，解螺旋，核膜和核纤层重建，纺锤体解体，胞质分裂。 动物细胞的胞质分裂是受微丝构成的收缩环控制，因为细胞松驰素B能对其抑制。（四）末期从子染色体到达两极，至形成两个新细胞为止的时期。涉及子核的形成和胞质分裂两个方面。 动物细胞的胞质分裂通过胞

11、质收缩环的收缩实现，收缩环由大量平行排列的肌动蛋白组成。 用细胞松弛素处理这一时期的细胞，会出现什么现象？Dividing Muscle Myoblast (primative muscle cell) (SEM x8,000) 植物细胞末期近两极处纺锤丝消失，中间微管保留，并数量增加，形成成膜体。 来自高尔基体囊泡沿微管转运到成膜体中间。融合形成细胞板(cell plate)，囊泡的内含物形成初生壁和中胶层，囊泡膜形成质膜，融合留下的管道形成胞间连丝。三. 减数分裂 ( meiosis)（一）减数分裂的特点及生物学意义 是生殖细胞成熟过程中的特殊有丝分裂，其特点是：一次DNA复制连续2次细胞

12、分裂，结果为染色体数目减半。 其生物学意义有2种，一是使亲代与子代之间的染色体数目保持恒定，保证物种的稳定遗传。二是在其过程中，发生了非同源染色体的随机结合，并以非姊妹ch单体之间的局部片段交换重组，从而增加遗传的变异性，增强了生物对环境变化的适应性。MeiosisConcepts:1. Gametic meiosis 配子减数分裂2. Sporic meiosis 孢子减数分裂3. Zygotic meiosis 合子减数分裂前减数分裂期细胞母亲同源染色体父亲同源染色体染色体复制 联会（二）减数分裂过程分析 第一次meiosis： 前期I（细线期偶线期粗线期双线期终变期）中期I， 后期I，

13、末期I（分裂间期or长or短，无DNA合成） 第二次meiosis：无前期II， 中期II， 后期II， 末期II。1）前期I各期形态功能特征： 细线期：染色体是细长盘绕的单条fibre，其上有众多ch粒分布。 偶线期：同源染色体开始配对配对区形成联会复合体结构（SC），此期有z-DNA合成即ZYG DNA，其活性转录与同源染色体配对有关。 粗线期：同源染色体配对完毕，联会复合体结构（SC）中呈现重组结结构，此期有p-DNA和组蛋白的合成，粗线期中每对联会的同源染色体结合紧密，形态短粗，称为二价体or四分体。 双线期：同源染色体之间局部分开形如“麻花”状， 这是粗线期发生同源染色体的非姐妹染色

14、体单体之间片段交换的结果，卵细胞双线期的RNA转录活跃。 终变期：染色体浓缩凝聚，交叉点移向染色体臂端（称为端化），核仁消失。2）其它时期的形态功能特征： 减数分裂meiosis I 的染色体行为有别于普通有丝分裂，是同源染色体配对分离，同源染色体分别趋向两极，而不是染色体单体分别趋向两极，这是由于每条染色体两侧的2个动粒移位朝向同一极的缘故，但这一对动粒究竟朝向哪一极是随机的，因为后期趋向某极的父方母方来源的染色体是随机组合，所以导致子代基因组的遗传变异。 遗传学研究证实，在偶线粗线期，同源染色体的非姊妹染色体单体之间发生局部片段的变换，造成子代染色体上的基因重组，meiosis所形成的4个

15、配子的单倍基因组各不相同，因此也是导致后代遗传变异的另一主要机制，而确保此期发生遗传物质交换的结构基础，是联会复合体。（三）联会复合体（cynaptonemal comphex . SC）P394: 联会时，同源染色体之间纵向平行联结在一起，电镜下可见，其联结间隙中有SC结构，这种亚微结构在各种动、植物中都基本一致。 SC主要由碱性蛋白质组成并含有RNA及微量的DNA，其结构形式为：在紧密配对的2条同源chr之间的间隙两侧各有一条深色的纵向分布的侧生组分，这2条侧生组分之间是100nm的宽的明亮中间区，而中间区中央有一条较浅的纵向分布的中央组分，其次，在侧生组分与中央组分之间又横向排列有许多S

16、Cfibre所以SC结构像“梯子”。Chromosome recombination 1Chromosome recombination 2Minimum number of gamete types = 2n , In humans, n = 23 SC组装始于偶线期，多由靠核膜的一端拉链式使2条chr靠拢配对，到粗线期联会完成并在非姐妹单体之间发生局部片段的交换重组，到双线期SC开始解体。 SC的功能： （1）维持同源染色体精确配对的结构； （2）确保非姐妹染色体单体之间的染色体片段交换的机构。 交换导致交叉，而不是交叉导致交换： 真核生物不是染色体单体片段直接交换，而是各自解旋的DNA链

17、之间发生交换（高度helix化，不是细丝，切断后不是一条线）。 现认为2条对应的DNA链分别由L-C fibre中央组分中，出现断口相互交换重组。 证据1：偶线期有Z-DNA合成，粗线期有P-DNA合成（单链修复）。 证据2：粗线期中，核酸内切酶，DNA聚合酶，连接酶等活性皆出现峰值。 证据3：粗线期中SC中可见椭圆形的重组节，这里含多种酶的重组机器。第二节 细胞周期的调控一、研究背景 1970s Rao和Johnson发现与M期细胞(Hela)融合的间期细胞染色体发生凝缩，称为早熟凝集染色体(prematurely condensed chromosome，PCC)。 G1期PCC为单线状，

18、因DNA未复制。 S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制。 G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。 甚至不同类的M期细胞也可诱导PCC产生，说明M期细胞具有促进间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子(maturation promoting factor， MPF)。PCC 早熟凝集染色体 1960s Leland Hartwell,1970s Paul Nurse 以芽殖酵母和裂殖酵母为实验材料，利用温度敏感突变株，发现许多与细胞分裂有关的基因(cell division cycle gene, CDC)。 如： 裂殖酵母cdc2、 芽殖酵母cdc28突变型在限制温度下无法

19、分裂； wee1突变型则提早分裂，cdc25突变型细胞体积增大而不分裂； cdc2和cdc28都编码一个34KD的蛋白激酶，促进细胞周期的进行，weel和cdc25分别表现为抑制和促进CDC2的活性。Fission yeast budding yeast Cdc 25 & Wee1 mutantCDC2蛋白激酶被抑制CDC2蛋白激酶被激活MPF=CDC2蛋白激酶+clyclin BWeel 抑制CDC2的活性Cdc25 促进CDC2的活性 1980s Timothy Hunt发现海胆的卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期振荡，命名为周期蛋白(cyclin A 和 B ) 。 后 来 发

20、 现 各 类 动 物 来 源 的 细 胞 周 期 蛋 白mRNA均能诱导蛙卵的成熟。 1988年Lohka将非洲爪蟾的MPF纯化。经鉴定MPF由32KD和45KD两种蛋白组成，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。 进一步的研究发现MPF=CDC2+clyclin BLeland H. Hartwell R. Timothy (Tim) Hunt Sir Paul M. Nurse 2001年10月8日美国人Leland Hartwell、英国人Paul Nurse、Timothy Hunt因对细胞周期调控机理的研究而获诺贝尔生理医学奖。二. 细胞周期运转的调控因子：1）促S期因子SPF： SPF是促成D

21、NA合成的启动因子，仅出现在S期细胞质中，由细胞融合证明。 说明SPF只存在于S期细胞中，G1、G2皆无，SPF诱导G1期细胞提前合成DNA但不能诱导G2再合成，还说明G2期并无DNA合成抑制因子。2）染色体超前凝集现象(PCC)：以M期的Hela 细胞分别与G1期、S期及G2期的Hela细胞相融合，发现那些原本不会出现染色体（chromosome）形态的间期细胞核居然呈现提早凝聚的染色体，其形态各异，由此揭示M期细胞中具有诱导染色质凝集的活性因子，统称为成熟促进因子 MPF。 PCC现象不受物种分类所限制，即人、牛、马、鸡、鱼、昆虫的细胞之间都能诱导PCC ，因此而言，MPF（有共性的）在真

22、核细胞中普遍存在的。三.MPF的生化本质和功能CDK激酶(细胞周期蛋白依赖性激酶)（MPF只存在于M期中） 1） 现已知从yeast到人类的所有真核细胞的M期启动是受同一机制调控的，即MPF其生化本质是蛋白质激酶，可催化若干种蛋白质发生磷酸化，而引起这些蛋白质的结构和功能状态的改变从而导致细胞内某些代谢活动的变化。 CDK1，可将特定蛋白磷酸化，促进细胞周期运行，又称作细胞周期引擎。 如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失； 将H1磷酸化导致染色体的凝缩等。 有活性的MPF实质是由P34 cdc2（CDK1 蛋白质）和周期蛋白两部分组成， P34 蛋白是cdc2基因的产物，其单独存在时无

23、激酶活性， M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的积累。 结合cyclin B的CDK1被Wee1将Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不断积累。 在M期，Wee1的活性下降，CDC25使CDK的Thr14，Tyr15磷酸化位点去磷酸化，去除了CDK活化的障碍。 CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDK activating kinase CAK)的作用下完成的。 所以P34 蛋白是MPF的催化亚单位，而周期蛋白则是MPF的调节亚单位。CDK activating2） 深入研究已知，这类蛋白质激酶复合体对细胞周期运行有重要作用，被喻为驱动细

24、胞周期。现已知有A、B、C、D、E、F、G、H等多种，其共同特点是细胞中呈现含量增长与消失的周期性变化规律，而且在不同阶段其为主的类型也有不同。 P34 cdc2激酶又称为周期蛋白质依赖性激酶 CDK1，现已知11种编码各种CDK的基因，各种CDK 蛋白质的作用时期不同，它们在细胞周期中含量不出现波动，仅发生去pi化与Pi化的周期性变化，故使得CDK激酶活性出现规律性变化，从而导致了细胞周期中一系列事件发生。 现认为:促S期因子SPF=周期蛋白A+ CDK2， 促 M 期 因 子 M P F = 周 期 蛋 白B/A+CDK1。3） 细胞周期中DNA copy仅发生一次的原因： 已知有Ora

25、, cdc6, cdc45和Mcm等蛋白质参与DNA的起始调控过程，Mcm是 MA复制执照因子的主要成份，仅在G1和S期存在。 还与周期蛋白E-cdk2激酶活性有关。四、细胞周期蛋白cyclin 特点：在细胞周期中呈周期性变化。含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合。 作用：激活CDK，引导CDK作用于不同底物。 已知30余种，在脊椎动物中为A1-2、B1-3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、H等。 分为4类：G1型、G1/S型、S型、M型。不同类型的CDK/cyclin复合体 *包括D1-3，各亚型cyclin D在不同细胞中的表达量不同，但具有相同

26、的功效。 G1期，在生长因子的刺激下，cyclin D表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录，如编码cyclinE、A和CDK1的基因。 G1-S期，cyclinE与CDK2结合，促进细胞进入S期。CyclinE的抗体能使细胞停滞于G1期。 在G2-M期，cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体。 cell cycle regulation 在中期当MPF活性达到最高时，激活后期促进因子APC，将泛素连接在cyclinB上，cycli

27、nB被蛋白酶体(proteasome)降解，完成一个细胞周期。 分裂期周期蛋白N端有一段序列与其降解有关，称降解盒(destruction box)。 泛素由76个氨基酸组成，高度保守。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。 26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。Destruction Box in Cyclins后期促进因子泛素蛋白酶体细胞周期的降解盒细胞周期的多聚泛蛋白蛋白酶体中期后期末期前期间期多聚泛蛋白蛋白酶体=周期蛋白B+CDK1后期促进因子 组成：感受器、信号传导通路、效应器。 主要检验点： G1/S

28、检验点：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restriction point)。 S期检验点：DNA复制是否完成？ G2/M检验点：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？ 中-后期检验点：纺锤体组装检验点。五、细胞周期检验点（check point）Four checkpoints ATM（ataxia telangiectasia-mutated gene）。 最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者，人类中大约有1%的人是ATM缺失的杂合子，表现出对电离辐射敏感和易患癌症。 ATM编码一个蛋白激酶，结合在损伤的DNA上，其信号通

29、路有两条。 激活Chk1（checkpoint kinase）, 使CDC25的Ser216磷酸化失去活性，抑制M-CDK的活性，中断细胞周期。 激活Chk2，使P53被磷酸化而激活，然后P53作为转录因子，导致P21的表达，P21抑制G1-S期CDK的活性，中断细胞周期。六、生长因子对细胞增殖的影响 单细胞生物的增殖取决于营养，多细胞生物细胞的增殖与信号途径有关。 生长因子：是与细胞增殖有关的信号物质，已知几十种，多数能促进细胞增殖，又称有丝分裂原（mitogen），如EGF、NGF。 作用方式：旁分泌。 信号通路：ras途径，cAMP途径、磷脂酰肌醇途径。 如通过ras途径，激活MAPK，MAPK进入细胞核内，激活c-myc，myc作为转录因子促进cyclin D、SCF、E2F等G1-S有关的基因表达，细胞进入G1期。 习题： 一. 名词解释： 1. SPF 2. MPF 3. 周期蛋白 4. Go期细胞 5. 联会复合体 二. 问答题： 1. 细胞增殖是如何调控的？ 2. 为什么子代与子代之