FasLmRNA在椎间盘细胞中表达的散布

1、FasL mRNA在椎间盘细胞中表达的散布司春祥陈伯华吕振华【摘要】 目的观看凋亡相关基因FasL mRXA在椎间盘细胞 中表达的散布。方式搜集胎儿及成人病理腰椎间盘髓核标本，PHA P激活单个核细胞诱导FasL表达，提取总RNA, RT PCR制备FasL 基因片段。定向克隆入质粒载体PSPT19多克隆位点构建重组质粒，体 外转录制备Dig FasL cRNA探针。cRNA探针原位杂交进行FasL mRNA 表达散布的观看。结果 克隆化FasL序列经DNA测序准确无误，体外 转录cRNA探针标记成效中意；胎儿腰椎间盘组织脊索细胞、软骨样细 胞中可检测到FasL mRNA的较高杂交信号，成人突

2、出椎间盘细胞中罕 有正常细胞，未检出FasL mRNA信号。结论FasL基因在胎儿期腰椎 间盘细胞内表达，细胞凋亡发生早。成年时期，细胞数急剧减少，代 谢功能低下，无法检出凋亡基因表达。【关键词】基因FasL RNA互补 椎间盘 原位杂交ABSTRACT Objective To observe the distribution of FasL mRXA in intervertebral disc. Methods Nucleus gelatinosus specimens were collected from fetus and pathologic disc. PBMC was tre

3、ated by PHA P, and total RNA extracted from the actived PBMC. A fragment of FasL gene was reversely transcripted and amplified from total RNA using one step RT PCR. PCR product was then inserted into the MCS of pSPT19. After verification ofDNA sequencing, the recombinant plasmid pSPT19 was linearize

4、d to synthesize the dig cRNA probe in vitro. The distribution of FasL mRNA was observed on lumbar intervertebral disc specimens using in situ hybridization. Results The inserted FasL cDNA fragment in pSPT19 FasL was identified by DNA sequencing. The label efficiency of cRNA probe was satisfied; The

5、FasL mRNA signals were emerged in both notochord cells and chondrocyte like cells in the nucleus of fetal discs. Conclusion The FasL mRXA was detected in the fetal lumbar intervertebral disc cells, and apoptosis occurred early. In adult, the quantity of intervertebral disc cells reduced, the metabol

6、ism of them decreased, and the expression of FasL mRNA could not be detected.KEY WORDS Gene, FasL; RNA, complementary; Intervertebral disc; In situ hybridizationFasL基因是目前已知的最重要的凋亡调控基因之一，属于肿 瘤坏死因子家族成员的凋亡增进因子，是Fas的配体。体内外多种因 素能够诱发FasL的表达，通过Fas的介导而产生一系列生化反映，最 终致使细胞的凋亡。研究证明，椎间盘组织的间盘细胞上有FasL表达, FasL相关的细胞凋

7、亡与腰椎间盘退行性变的发生有关12。但其mRNA 表达的研究未见报导。本研究通过克隆FasL cDNA片段制备地高辛标 记的FasL cRNA探针，利用原位杂交方式对椎间盘中FasL mRNA的 散布进行观看。1材料与方式要紧试剂及仪器设备PHA P、DEPC购自Sigma公司，APES购自上海生物工程公 司。pSPT19质粒载体、大肠杆菌JM10九、EasyHyb、分子克隆所用试 剂盒、工具酶及所用仪器设备由青岛大学医学院附属医院中心实验室 提供。标本来源搜集胎龄5月的胎儿及手术掏出的椎间盘髓核标本10例， 置无菌EP管中液氮速冻后-70 保留。10例病人中，男6例，女4例; 年龄3265岁

8、，中位年龄50岁；病程6月5年，平均年。L4, 5者5 例，L5sl者4例。引物设计引物依FasL mRNA序列（）设计，其上游、下游引物别离来 自mRNA序列。PCR产物长334 bp。上游引物的5'端修饰Pst I酶切 序列，下游引物5,端构建EcoRi酶切位点，CTC爱惜。引物由北京 华丽公司合成。上游引物：5 ' CTC CTGCAGGCCCTTCAATTACCCATATCCC 3 ', 下游引物：5 ' CTCGAATTCGAGTTCTGCCAGCTC CTTCTGT 3'。人Fas L基因片段的克隆化FasL基因的诱导表达及总RNA的制备人全

9、血1 mL, 100 g/L 的EDTA抗凝;分离单个核细胞，加入50 mmol/L PHA P 37 激活 15 min;然后 37 孵育 1 h, QIAamp RNA blood Mini kit 提取总 RNA。cDNA的合成 依照QIAamp RNA Blood Mini kit说明，在反 映混合液中加入以下试剂：5 X Buffer 10 U L； 10 mmol/L dNTP uL； 5XQ液10 口 L；上、下游引物各Umol/L； RT PCR酶复合物UL； Rnasin 30 U；总 RNA 1 U g （经 70 温育 5 min）,整体积 50 U L。 反映条件：50

10、 预变性30 min；然后95 15 min, 94 1 min, 52 1 min, 72 1 min,共 40 个循环；最后 72 延伸 10 min。 QIAquick Gel Extraction kit 进行胶上 PCR 产物回收。PCR产物的克隆PCR产物和质粒载体pSPT19别离进行EcoR I > Pst I双酶切，15 下T4连接酶连接反映16 ho转化感受态大 肠杆菌JM109 （C&C12法制备），氨茉青霉素抗菌及PCR快速挑选获阳 性重组子。碱裂解法提取质粒，酚氯仿法抽提。DA测序委托北京华丽公司测序。体外转录制备cRNA探针EcoR I酶切线性化重组质粒

11、pSPT19,纯化、定量，按试剂盒 说明，RNA聚合酶T7体外转录制备Dig FasL cRNA探针。原位杂交杂交前处置载玻片及盖玻片经APES防脱片剂处置。组织块 经40 g/L多聚甲醛 PBS (pH )前固定45 min,入300 g/L蔗糖 PBS留宿。OCT包埋，冷冻切片，厚度10 Umo 40 g/L多聚甲醛 PBS (pH )后固定10 min, PBS洗涤3 min,共2次。37 烤干2 h。密 封，-70 贮存。原位杂交 切片复温，2 g/L Triton X 100 PBS液洗 15 nlin 后，PBS 洗 3 nlin,共 2 次；lOmg/L 蛋白酶 37 消化 15

12、 min； 冰预冷的2 g/L Glycine PBS液洗3 min, 3次；g/L乙酸酎作用 10 min后PBS液洗3 min； EasyHyb中按1 g/L加入cRXA探针制备杂 交液，每片加30 UL,加盖玻片。封口膜封锁，置入湿盒，42 下 杂交16 he杂交后处置2XSSC42 洗涤5min,共4次；XSSC42 洗涤 30 min,共 2 次；Bufferl 液 25 振荡洗涤 2 nlin； Buffer2 液 25 c振荡洗涤 3 min；抗 Dig 抗体(1 ： 1500) 37 作用 2 h； Buf ferl作用15 min,共2次；Buff er 3作用3 min。切

13、片加显色液 (buffer3+ NBT/BCIP) 37 显色 2 ho Bufferl 别离作用五、2 min 终止显色并摄影。结果判定以细胞胞浆显现蓝紫色染色为FasL n)RA阳性信号。2结果RT PCR产物的鉴定RTPCR产物于琼脂糖凝胶上电泳显示，在约328 bp处呈现1条与预期产物相对分子质量大小相符的DNA扩增条带。见图lo图1 RT PCR产物于琼脂糖凝胶电泳结果(略)M 为 pGEM7Zf (+)DNA/Hae III Marker； F 为 RT PCR 产物。DXA测序双脱氧法测序结果与GenBank ()中发表的序列相符，证明 插入的FasL序列准确无误。见图2。图2

14、FasL DNA测序结果(略)胎儿及成人椎间盘的观看胎儿腰椎间盘组织中，髓核部位可见脊索细胞、软骨样细胞 散布较为密集，形态正常。髓核近中央部位部份细胞成簇排列，胞浆 内显现蓝紫色染色颗粒，表达FasLmRNA阳性信号。周边近纤维环区 细胞密集，弱阳性细胞和阴性细胞混杂。纤维环部位胶原纤维排列整 齐，少见细胞。突出髓核可见椎间盘组织呈典型的退行性改变，髓核 纤维化显著，胶原纤维排列紊乱，基质显现大量空泡样变，细胞含量 稀少，罕有正常细胞，未检出FasL mRNA信号。3讨论Dig FasL cRNA探针与mRXA的检测经常使用的检测mRXA的方式有原位杂交、Nor them blot、 Dot

15、 blot> RT PCR等多种方式。ANGERER等1第一应用RXA探针于 原位杂交。与cDNA探针相较，cRXA探针有与组织中mRNA杂交效率高、 杂交体稳固、假阳性少、杂交前不用高温变性等优势。因此，利用cRNA 探针可使实验有更高的严谨性2。用地高辛标记的探针具有对人体无 害且可长期保留3,特异性强的优越性。cRNA探针不仅可应用于切 片上的原位杂交，还可应用于Southern印迹杂交法检测特定基因组序 列等。腰椎间盘退行性变与细胞凋亡腰椎间盘退变的发病机制是多因素的。非生理性的机械负重 是一个中心病因学因素，生物学因素也起了重要的作用。K0HYAMA等 4证明在突出的椎间盘中细

16、胞凋亡的发生率高于对照组。JEFFREY等 5应用外部紧缩装置研究静态紧缩应力对椎间盘的作用，说明凋亡细 胞的百分率与紧缩应力及负载时刻有关。GRUBER等6报导，在腰椎 间盘中细胞凋亡的发生率高、细胞活性降低并在增龄和退变进程中产 生片状产物，围绕在细胞周围形成隔离屏障，可阻碍单个核细胞的活 性和细胞间通信。FasL与腰椎间盘退变退变腰椎间盘的要紧病理改变成因多种缘故所致的细胞凋亡，椎间盘细胞数量减少及椎间盘基质的降解。当软骨样细胞死亡增 加，其合成细胞外基质的能力下降，不能有效地维持椎间盘基质的胶 体渗透压，从而致使椎间盘脱水及退变。Fas/FasL系统参与突出椎间 盘组织细胞的凋亡。TR

17、OUT以为在脊柱发育完成后，髓核中的活细胞中仍具有功 能7。也有人以为椎间盘中细胞随着年龄的增加而显现必然程度的增 加，但有活力的细胞数量下降，其中大部份活力低下乃至死亡8。细 胞死亡有两种大体方式，即坏死和凋亡。研究显示，人类腰椎间盘组 织中存在凋亡的软骨样细胞9。研究证明，突出椎间盘的间盘细胞上 有FasL及Fas表达。Fas/FasL可能诱导退变腰椎间盘组织进行超常 的凋亡，从而降低了椎间盘髓核H型胶原的产生，增进了退行性变的 发生，加速了腰椎间盘突出症的进程1013。这可能是腰椎间盘退 变发生及进展的机制之一。总之，木文研究显示，胎儿腰椎间盘内细胞密集、形态正常, 内有FasL mRN

18、A散布。而在腰椎管狭小掏出的椎间盘中细胞数量减少。 病理性腰椎间盘中呈现出明显的退行性变，细胞稀少几乎无正常细胞 结构可见，FasL mRNA信号未能检出。【参考文献】UANGERER L M, AXGERER R C. Localization of mRNAs byin situ hybridizationJ. Methods Cell Biol, 1991,35:3771.2杜卫东，周晓虹,马学玲，等.地高辛标记cDNA探针组织 及细胞mRNA原位杂交技术J.临床与实验病理学杂志， 1997, 13(1) :7780.3蔡文琴，王伯.有效免疫细胞化学与核酸分子杂交技术 M.成都：四川科学

19、技术出版社，1994:354432.4K0HYAMA K, SAURA R, DOHA M, et al. Intervertebral disc cell apoptosis by nitric oxide: biological understanding of intervertebral disc degenerationJ. Kobe J Med Sci, 2000,46(6): 283295.5JEFFERY C, LOTZ JENNIE R, CHIN J P, et al. Intervertebral disc cell death is dependent on the m

20、agnitude and duration of spinal loadingJ. Spine, 2000,25(12):1471.6GRUBER H E, HANLEY E N J R. Analysis of aging and degeneration of the human intervertebral disc. Comparison of surgical specimens with normal controlsJ. Spine, 1998,23(7) : 751757.7高慧英,王洪海,赵炳章.椎间盘的形态学国腰椎间盘突出症.北京:人民军医出版社,2001:50.9BAYLISS M T, URBAN J P, JOHNSTONE B, et al. In vitro method for measuring synthesis rates in the intervertebral disc J. J Orthop Res, 1986, 4:1017.9GRUBER H E, HANLEY E N. Analysis of