Ames试验和umu试验

1、一.AmesM验1、基本介绍Ames试验全称污染物致突变性检测。污染物对人体得潜在危害，引起人们得普遍关注。世界上已发展了百余种短期快速测 试法，检测污染物得遗传毒性效应。B. N. Ames等经十余年努力，于 1975年建立并不断发展完善得沙门氏菌回复突变试验（亦称AmeS式验）已被世界各国广为采用。该法比较快速、简便、敏感、经济，且适用于测试混合物，反映多种污染物得综合效应。众多学者有得用 Ames试验检测食品添加剂、化妆品等得致突变性，由此推测其致癌性；有得用Ames试验检测水源水与饮用水得致突变性（比如，美国派斯净水器就通过了Ames试验），探索较现行方法更加卫生安全得消毒措施；或检测

2、城市污水与工业废水得致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据；有得检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬得致 突变性，以防止维系生命得土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类； 检测气态污染物得致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害；用Ames试验研究化合物结构与致变性得关系，为合成对环境无潜在危害得新化合物提供理论依据；检测农药在微生物降解前后得致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患；还有用Amesi式验筛选抗突变物，研究开发新得抗癌药等等。 2、目得与原理鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium ）得组氨酸营养缺陷型（hi

3、s ）菌株，在 含微量组氨酸得培养基中，除极少数自发回复突变得细胞外，一般只能分裂几次， 形成在显微镜下才能见到得微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见得菌落。 某些化学物质需经代谢活化才有致变作用，在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶，可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。鉴于化学物质得致突变作用与致癌作用之间密切相关，故此法现广泛应用于致癌物得筛选。实验用菌株得细胞壁还有能使实验物易于渗透得突变。为了进一步增加试验得敏感性，这些菌株得切除修复 DNA导能力就是缺陷得，并且还有提高错误倾向得 DNAW复得质粒基因。 3、步骤与方法Ames试验得常规方法有斑点

4、试验与平板掺入试验。1.菌株鉴定 用于测试得菌株，需经基因型与生物学性状鉴定，符合要求才能投入使 用。目前推荐使用得一套菌株就是TA97、TA9& TA100与TA102。鉴定前先进行增菌培养。为鉴定结果可靠，需同时培养野生型TV菌株，作为测试菌基因型之对照。增菌培养用牛肉膏蛋白月东液体培养基，接种后于37 C, 100r/min振荡培养12h左右，细菌生长相为对数期末，含菌数应为 1 X 109个/ml2X 109个/ml。鉴定项目：（1）脂多糖屏障丢失（rfa ）用接种环或一端挠起得接种针以无菌操作术取各菌株得增菌培养液，在营养琼脂平板上分别划平行线，然后用灭菌尖头镣夹取灭菌滤纸条

5、，浸湿结晶紫溶液，贴放在平板上与各接种平行线垂直相交。盖好皿盖后倒置于 37t温箱，培养24h 后观察结果。(2) R因子 划线接种，贴放滤纸条及培养等均同上，唯滤纸条浸湿得药液不同， 为氨 茉青霉素钠溶液。TA102除pKM101外，还有pAQ1载有抗四环素得基因，故另用滤纸条浸 湿四环素溶液后贴放于划线接种得平板上。(3)紫外线损伤修复缺陷( uvrB)在营养琼脂平板上按上述方法划线接种后，一半 接种线用黑玻璃遮盖，另一半暴露于紫外光下8sec,然后盖好皿盖并用黑纸包裹平皿，防止可见光修复作用。培养同上。(4)自发回变 预先制备底平板；向灭菌并在水浴内保温 45c得上层软琼脂中注入 0、

6、1ml菌液；混匀后倾于底平板上并铺平。平皿倒置于37c温箱培养48ho(5)回变特性一一诊断性试验上层软琼脂中除菌液外，还注入已知阳性物之溶液，需活化系统者并加入 S9mix,余同上。组氨酸营养缺陷型由自发回变即可知。2 .斑点试验吸取测试菌增菌培养后得菌液0、1ml,注入融化并保温 45 c左右得上层软琼脂中，需 S9活化得再加0、3ml0、4mlS9mix,立即混匀，倾于底平板上，铺平冷 凝。用灭菌尖头镣夹灭菌圆滤纸片边缘，纸片浸湿受试物溶液，或直接取固态受试物，贴放于上层培养基得表面。同时做溶剂对照与阳性对照，分别贴放于平板上相应位置。平皿倒置 于37c温箱培养48h。在纸片外围长出密集

7、菌落圈，为阳性；菌落散布，密度与自发回变相似，为阴性。3 .平板掺入试验 将一定量样液与0、1ml测试菌液均加入上层软琼脂中，需代谢活化 得再加0、3ml0、4ml S9mix ,混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝。同时做阴性与阳性对 照，每种处理做3个平行。试样通常设 4个5个剂量。选择剂量范围开始应大些，有阳性 或可疑阳性结果时， 再在较窄得剂量范围内确定剂量反应关系。培养同上。同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比，为致变比( MR。 MR直2,且有剂量 -反应关系，背景正常，则判为致突变阳性。二.UmuM验1原理当DNA大范围受损，复制受抑制情况下，细胞产生一种易错修复

8、(error-prone re-pair) 功 能，称为SOS修复，此时细胞表现为 DNA修复功能增强、细胞生长正常但分裂受抑制基 因突变增加、呼吸受阻等，而细胞受理化因素损伤产生得寡核甘酸、单链或缺口双链 DNA等成为诱导信号，使无活性得Re-cA蛋白被激活，激活得RecA蛋白可与单链 DNA(ssDNA) 结合形成RecA ssDNA核蛋白体，后者介导LexA蛋白裂解，LexA 蛋白水平得下降可诱导 SOS调节子，大量转录recA 基因，同时也激活原被LexA 蛋白阻遏得 SOS相关基因umuC、umuD等。以上得一系列反应为SOS反应。SOSUmu测试系统正就是基于 DNA损伤物诱导SO

9、S反应而表达umuC基因得能力，在鼠伤寒沙门菌 Salmonella typhi-murium TA 1535中导入携带umuC' Lac Z嵌合体得质粒 pSK 1002,该质粒携带umu操纵子、umuD 基因与umuC Lac Z融合基因得启动子及四环素与氯霉素耐药基因，允许通过药物选择转化株，新构建得细菌称为 S、typhi-murium TA 1535 pSK 1002。当细菌受诱变物作用引起SOS反应时，激活umuC' Lac Z融合基因，表达出有3 -半乳糖甘酶活性得融合蛋白，通过 检此酶得活性可以确定受试物引起DNA损伤得程度，若加入S9混合液，则可以检测化学物就

10、是否经代谢活化生成损害DNA得产物。2试验菌株2、1 S、typhimurium TA 1535 pSK 1002就是umu试验得最初测试株，其构建如前所述，它也就是构建其它测试株得基础。2、2 S、typhimurium NM2009氨基偶氮染料与芳香胺能被 P450乙酰转移酶系统活化成有活性得代谢产物，因而将构建得含有 O-乙酰转移酶基因得质粒 PNM12导入S、typhimurium TA 1535 pSK 1002 菌 株从而形成S、typhimurium NM2009,可以加强检测这类化学物得敏感性。2、3 S、typhimurium NM3009许多硝基芳煌类物质只有被硝基还原酶O

11、-乙酰转移酶系统代谢激活后才有活性，为构建对此类化学物高度敏感得细菌株，将构建得含有硝基还原酶及。-乙酰转移酶基因得质粒 PNM13导入原始 S、typhimurium TA1535 pSK 1002, 即成 S、typhimuriumNM3009 。 2、4 S、typhimurium NM5004将含有大鼠 GST 5-5 cDNA 与umu操纵子得质粒导入宿主细菌S、typhimuriumTA1535。S、typhimurium NM5004 得 GST活性比 S、typhimurium TA 1535 pSK 1002 高 52倍，因而检测那些经 GST代谢活化或失活得环境化学物非常有

12、效。3操作过程细菌贮存：细菌株可由Oda博士提供（日本大阪府立公共卫生研究所）。将少量细菌置于含25mg L氨芳青霉素与10mg L氯霉素得LB培养基中，剧烈振荡37 c孵育过夜。加30% 甘油或10%二甲亚碉（V/V）,孵育体系分为几份于 23ml管中，以液氮或干冰-丙酮快 速冷冻，保存于-80 C。细菌生长：将少量冷冻细菌放入含氨芳青霉素及氯霉素得LB培养基，37 C振荡孵育过夜。次日上午，以新鲜TGA培养基20倍稀释培养液，继续孵育至菌液光密度在600nm时OD直达0、250、3,试验前置于冰上。孵育混合体（终体积2、5ml）:0、1ml溶于DMSm水中得受试物（受试化学物浓度一般 大约

13、为0、01mmol/L ,当测试弱得诱变物时，浓度可提高到 0、1mmol/L）, 2ml上述细菌悬 液,0、4ml 0、1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7、4）或含有40 “ S9得S9混合液（G6PD NADP+ 及G6PD脱氢酶等）。37c振荡孵育2h,将管放在冰上终止反应。评价3 半乳糖甘酶活性：（1）将0、2ml上述混合体系转移至新管中。（2）依次加1、8mlZ-缓 冲液（含 60mmol/L Na 2 HPC4 , 40mmol LNaH 2 PO 4 ,10mmol/L KCl ,1mmol/L MgSO 4 , 用前加0、35ml终浓度为50科mol/L得硫基乙醇到100ml缓

14、冲?中，此缓冲液不需高压灭 菌）,0、05ml 0、1%十二烷基磺酸钠（SDS）（W /V）,5 小氯仿。以搅拌器剧烈混合以裂解细 菌。（3）与0、10ml邻硝基苯半乳糖昔溶液 （4、0g/L）混合，28c或37 c孵育15min。 （4） 加1ml得1mol/L碳酸钠终止反应 。（5）在420nm与550nm测量吸光度。细菌生长试验：以上述剩余得孵育体系在A600测量可知细菌得生长。结果评价：酶活性单位（units ml-1 ）= 1000X （OD 420 -1、75XOD550 ） （t Xv x OD 600 ）, 其中t为孵育时间，这里指15min,v 代表转入新管中得混合体系得体积

15、，这里指0、2ml 0如酶活性较对照组大于一倍或以上即可认为就是阳性结果。4 应用4、1 遗传毒理学Reifferscheid 比较了 274种化合物分别以umu试验及Ames试验检测得结果，发现 在检测化合物遗传毒性方面两者大约有90%导一致性，虽然用Ames试验（至少用5个细菌株）可以检测出97%得umu试验阳性物（154种），而umu试验只能检测出86%得Ames阳 性物（173种），但其余得14 %中只有6种为致癌物；Reifferscheid还分析了 149种致癌物与25种非致癌物以umu试验检测得结果，发现该试验假阴性率与假阳性率分别为 36%< 28%,但其阳性预测值高达

16、93%。umu试验同Ames试验敏感性相似,而新建立起得几 个测试株对检测芳香胺与硝基芳煌类化学物得敏感性大大提高；而且它还可检测在标准Ames试验中细胞毒性较大得化学物 ;umu试验周期短（几小时）,因而对细菌污染不敏感。在 SOS基因中umu基因与突变得发生密切相关 ，同SOS显色试验相比，其更能忠实地反映化 学物得诱变性。综上所述，umu试验具有简单、快速、敏感、廉价等特点。目前已广泛应用于各类化 学物得遗传毒性检测，如各种金属盐类、单个化学物及复杂得环境混合物。如结合适当得 空气采集装置，umu试验可用于原位检测职业场所得遗传毒物。4、2酶代动力学分析大量前致癌物必须通过微粒体 P450酶代谢活化才具有生物活性，利用umu测试系统 对研究生物活化得机制很有价值，通过特定得抗体