实验4 微生物对表面活性剂的降解

1、微生物对表面活性剂的降解微生物对表面活性剂的降解熊金波熊金波 11.1.实验目的实验目的v了解微生物对有机物的降解；v掌握微生物对有机物降解效率的测定。22. 2. 实验原理实验原理v表面活性剂：表面活性剂：具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列，使表面张力显著下降的物质。v表面活性剂是合成洗涤剂的主要有效成分，多是直链型烷基苯磺酸盐类（LAS）。v水体： 导致水生细胞膜透性增加，胞内物质外渗，最终引起细胞解体。产生泡沫，阻碍水体和大气间的气体交换，引起水质恶化。3LAS 的生物降解过程的生物降解过程4氧化使烷基链末端的甲基被氧化为羧基氧化使烷基链末端的甲基被氧化为羧基;氧化使羧基被氧

2、化并从末端分解脱落两个碳原子氧化使羧基被氧化并从末端分解脱落两个碳原子微生物解能力受菌株类型、表面活性剂浓度及其微生物解能力受菌株类型、表面活性剂浓度及其他理化因素影响他理化因素影响3.3.实验材料和方法实验材料和方法v菌种：菌种：气单胞菌气单胞菌D-4（Aeromonas sp . D 4）v考察不同起浓度考察不同起浓度LASLAS对微生物降解率的影对微生物降解率的影响响v培养基：培养基：蛋白胨0.5g ；NH4NO3 0.5g ;KH2PO4 0.1g; K2HPO40.1g; NaCl 0.5g；蒸馏水蒸馏水100ml；pH 6.77.2; 灭菌备用。（每组（每组4 4瓶）瓶）v合成洗涤

3、剂：合成洗涤剂：4种浓度的培养液（含LAS：40、120、180、240 mg/L）。培养液分装于500ml三角瓶，每瓶注100ml，不同LAS浓度标记清楚，灭菌备用。53.3.实验材料和方法实验材料和方法v亚甲基蓝溶液：亚甲基蓝溶液： 100mg 亚甲基蓝溶于100ml蒸馏水。取30ml于1000ml 容量瓶中，加6.8ml纯H2SO4 和50g NaH2PO4.2H2O, 定容至1000ml。vLAS标准溶液标准溶液： 称取LAS 0.5 （99.5LAS标准品）溶于500ml 蒸馏水，浓度为1mg/ml。取此液10ml稀释至1000ml，则LAS浓度为0.01mg/ml = 10mg/L

4、。v洗涤液洗涤液 ： 取6.8ml分析纯浓H2SO4及50gNaH2PO4.2H2O溶于蒸馏水并稀释至1000ml64.4.实验方法实验方法v接种：气单胞菌D-4斜面菌种1支，10ml无菌水洗下菌苔，充分摇匀打散，制成浓菌液。v每瓶培养液中接入菌液1ml，每种LAS浓度接1瓶，另设1瓶不接种作负对照。v培养培养: : 32，振荡200r/min培养48h。离心除去菌体（8000 r/min离10min），上清液留作测定LAS用。74.4.实验方法实验方法 LAS测定测定 v绘制标准曲线： 取0ml、2ml、5ml、10ml、15ml、20ml LAS 标准液（0.01mg/ml）稀释至100m

5、l制成不同浓度标准液。标准液100ml装于250ml分液漏斗中，用H2SO4调节pH值至微酸性，加亚甲基蓝液25ml。v1.向上述分液漏斗中加氯仿10ml，猛烈振荡30s，静置分层，将氯仿层排入另一个250ml分液漏斗，如此提取二次。(萃取剩余LAS）v2.洗涤：在上述提取液中加入50ml洗涤液，剧烈振荡30s，静置分层，将分液漏斗中的氯仿层缓缓放下至一个50ml容量瓶中。v3.再次提取：加氯仿6ml于步骤的水液中，振荡分层后将氯仿层并入上述步骤容量瓶中。如此提取二次，然后用氯仿稀释至50ml刻度处。v4.测定LAS：用纯氯仿做空白对照，波长为652nm，测定各标准液的光密度值（OD）。以光密

6、度值做纵坐标，LAS的毫克数（LAS原标准溶液浓度0.1mg/ml所取该液的毫升数）做横坐标，绘制标准曲线，并通过图解法求出标准曲线的斜率K。8标准曲线示意图9培养液测定培养液测定v取离心后的培养液上清110ml，于250ml分液漏斗中，用蒸馏水稀释至100ml。v同绘制标准曲线步骤，测得样品的氯仿提取液的光密度值。v按下式计算样品中LAS浓度10LASLAS降解降解度计算度计算11D为降解度，；C0为振荡培养开始时的起始LAS浓度，mg/L；Ct为振荡培养若干小时后的残留LAS浓度，mg/L。修正：修正：如果未接菌液的空白对照经培养后，LAS也有所减少，其差值为C(mg/L)，则5. 5. 实验报告实验报告v1 . 绘出对LAS的曲线。v2. 计算微生物对LAS的降解速率并阐述在降解过程中应注意的事项。v3. 分析不同的浓度LAS对微生物的降解速率的影响。12光合细菌的富集培养光合细菌的富集培养熊金波熊金波 13光合细菌的富集培养光合细菌的富集培养v1.采样：选取有机污染严重的水塘或有机质丰富的园地做为采样地点。v2.样品的富集： a 无菌操作分别取泥样1g或水样1mL于厌氧管中（厌氧管已灭菌）； b 加液体培养基至满，拧上螺口帽，造成厌氧环境； c 在温度为3