elisa酶联免疫吸附实验报告

1、elisa酶联免疫吸附实验报告 e is 酶联免疫吸附实验报告 得目验实.一酶联免疫吸附测定(enzymelined immunsorbet assay 简称 eisa)就是在免疫酶技术(imunoenzymati echnius)得基础上发展起来得一种新型得免疫测定技术，la过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原)， 再加相应酶标记抗体(抗原）,生成抗原（抗体)-待测抗体(抗原）-酶标记抗体得复合物,再与该酶得底物反应生成有色产物。借助分光光度计得光吸收计算抗体（抗原）得量。待测抗体(抗原)得定量与有色产生成正比。 理原验实.二用于免疫酶技术得酶有很多，如过氧化物酶,

2、碱性磷酸酯酶,d半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶,6磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ia 法得酶有辣根过氧化物酶,碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化得就是氧化还原反应,在呈色后须立刻测定,否则空气中得氧化作用使颜色加深,无法准确地定量. 辣根过氧化物酶（hp）就是一种糖蛋白,每个分子含有一个氯化血红素（protoei）区作辅基。酶得浓度与纯度常以辅基得含量表示。氯化血红素辅基得最大吸收峰就是 40m，hrp 酶蛋白得最大吸收峰就是 27nm，所以酶得浓度与纯度计算式就是（已知 hp 得 a（cm 43nm 1%)5，式中 1% 指rp 百分浓度为 100m含酶蛋白

3、 1g，即 10mg/,所以,酶浓度以 mg/m 计算就是rp 得 a(cm 403m ml=2、5)rp 纯度（)=a403nma275nm 纯度 rz（reihet ahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度 hr得 r值在、0 左右,最高可达 3、4.用于lisa 检测得 hrp 得 rz 值要求在、以上.):条三有理原本基得 asil1（就能可，面表体载相固于附吸地性理物以能体抗或原抗是蛋白与聚苯乙烯表面间得疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性; (2)抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学与酶学活性;)3(酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加

4、入底物得颜色反应来判定就是否有免疫反应得存在,而且颜色反应得深浅就是与标本中相应抗原或抗体得量成正比例得,因此,可以按底物显色得程度显示试验结果。 elsa 法就是免疫诊断中得一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起得传染病、寄生虫病及非传染病等方面得免疫诊断。也已应用于大分子抗原与小分子抗原得定量测定,根据已经使用得结果，认为 elisa 法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点.不仅适用于临床标本得检查,而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体,而且也可用于测定体液中得循环抗原，所以也就是一种早期诊断得良好

5、方法。因此 es法在生物医学各领域得应用范围日益扩大,可概括四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份得定位。 2、研究抗酶抗体得合成。 3、显现微量得免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。 基本方法一 用于检测未知抗原得双抗体夹心法: 、1 液冲缓被包盐酸碳牰、9hp 0、0 用：被包将抗体稀释至蛋白质含量为10g/l。在每个聚苯乙烯板得反应孔中加 0、1l，4过夜。次日,弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗次，每次 3 分钟。（简称洗涤,下同)。 2、 加样:加一定稀释得待检样品、1ml 于上述已包被之反应孔中,置孵育小时.然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔） 、 体抗标酶

6、得释稀鲜新入加,中孔应反各于:体抗标酶加（经滴定后得稀释度）0、1ml。37孵育 0、51 小时，洗涤。 、 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制得 tmb 底物溶液 0、1m,3700 分钟。 、5 终止反应:于各反应孔中加入 2硫酸 0、5ml。 6、 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色得深浅,以"'、"'号表示。也可测 od 值:在 elisa 检测仪上,于0nm（若以 abts 显色，则 410n)处,以空白对照孔调零后测各孔 od 值，若大于规定得阴性对照 od 值得、

7、1 倍，即为阳性。 基本方法二 用于检测未知抗体得间接法:、0 加孔每 ，m1 至释稀原抗知已将液冲缓被包用m，4过夜。次日洗涤次. 做时同(。涤洗，时小 1 育孵3 置,中孔应反之被包已述上于 lm1、0)体抗知未(品样检待得释稀定一加 空白、阴性及阳性孔对照） 于反应孔中，加入新鲜稀释得酶标第二抗体（抗抗体)、1m,37孵育 3060 分钟,洗涤,最后一遍用 ddw洗涤。 其余步骤同"双抗体夹心法'得 4、。( 物底与酶 ）二酶结合物就是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结得产物。就是 eli成败得关键试剂,它不仅具有抗体抗原特异得免疫反应,还具有酶促反应,显示出生

8、物放大作用,但不同得酶选用不同得底物技疫免术常用得酶及其底物 酶 底物 显色反应 测定波长 *94 色红橘 胺二苯邻 酶物化氧过根辣四甲替联苯胺 黄色 0* 4 色棕 酸杨水基氨邻联苯甲胺 兰色 425 2，2连胺基(-乙基-并噻唑啉磺酸6）铵盐 蓝绿色 64（盐酸磷酚基硝4 酶酯酸磷性碱n) 黄色 400 萘酚amx 磷酸盐+重氮盐 红色 5+糖萄葡024,504 色黄 糖萄葡+rh+stb 酶化氧糖萄葡甲硫酚嗪+噻唑兰 深蓝色 0，06 光荧 )m4（苷糖乳半基酮伞基甲 酶苷糖乳半- 硝基酚半乳糖苷(ong) 黄色 420 终止剂为 2ml/l h2 * 。剂止终得同不有物底得同不 ,酸檬

9、柠 l/lo 2 为剂止终可催化下列反应： r+2o2复合物 复合物+h过氧化物酶+h2+ ah2 -为无色底物, 供氢体; a 为有色产物。( 法方种四得用常sile )三1直接法测定抗原 ；面表体载在附吸原抗将加酶标抗体,形成抗原抗体复合物; 。量原抗量解降得物底.物底加 2。间接法测定抗体 ；面表体载相固于附吸原抗将加抗体， 形成抗原-抗体复合物； 加酶标抗体; 。量体抗=量解降得物底定测 .物底加3。双抗体夹心法测定抗原合复体抗-原抗成形,原抗加;面表相固于附吸体抗得得获物动种一第疫免原抗将物; ;物合复体抗原抗体抗成形,体抗得得获物动种二第疫免原抗加加酶标抗抗体(第二种动物抗体得抗体

10、）; 。量原抗=量解降得物底。物底加 、4 ;面表体载相固在附吸体抗将原抗定测法争竞)1(）;原抗标酶入加（,)2(抗测待与原抗标酶入加 原; 。量原抗知未=差得量解降物底孔品样与孔照对。物底加三。仪器与材料 1、 聚苯乙烯微量细胞培养板（平板， 40, 9孔). 、2 仪测检疫免联酶、3兔抗羊酶物化氧过根辣i， 工作稀释度 1:00。 4、 包被液:0、05moll ph、6 碳酸缓冲液，4，保存, aco3 0、5 克， ho3 0、93克,蒸馏水稀释至 100 ml。 5、 稀释液:、0lph7、4 ps-tween-20， 4，保存、 nac 8g， 2po4 0、2， a2hpo4、

11、1h2o 2、g， twen0,0、m、 蒸馏水加至 1000。 、6同:液涤洗稀释液 7、 封闭液:、%鸡卵清蛋白,ph7、4 pbs。 8、 邻苯二胺溶液（底物):临用前配制 、1 柠檬酸（2、1100ml), 、1ml 0、m na2h、h2o (7、163g00ml) 6、4m, 蒸馏水 12、ml, 邻苯二胺0mg, 溶解后, 临用前加 30%ho 0 微升。 9、 终止液:2ol/h2so4。 骤步作操 、四1、 包被抗原:用包被液将抗原作适当稀释， 一般为 11微克/孔，每孔加00 微升，3温育 1 小时 后，4冰箱放置18 小时。 、2将后最,次三复反,钟分三放静，液涤洗满加，体液中孔板尽倒:涤洗反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。 、3 .时小一置放73，升微 002 液闭封加、 洗涤同 2. 、573