基因分型技术

1、 个体化诊断的内容个体化诊断的内容 个体化诊断的技术简介个体化诊断的技术简介 技术原理技术原理年龄年龄老年人老年人儿童儿童新生儿新生儿 性别性别身高身高/体重体重 并发症并发症病程病程 什么是个体化分子诊断脏器功能脏器功能肝肝, 肾肾, 心心环境因素环境因素饮食饮食 / 吸烟吸烟/ 合并用药合并用药药物反应个体差异药物反应个体差异基因基因个体化基因检测方向 突变 （mutation） 表达水平（level of expression)o甲基化修饰（methylation)基因突变检测技术 测序； 探针；o质谱；基因突变检测技术测序测序探针探针质谱质谱原始信号原始信号光光光一级信息一级信息探针结

2、合分子量二级信息二级信息序列是否改变分子大小是否改变推论推论推论推论最终信息最终信息 碱基序列是否改变碱基序列是否改变PPiATPLightlighttimeSignal45%E ES SGGT TC CT TGG5T TC CGGT TA A10GGT TC CGGC C15T TGGA AT TC C20GGT TA AGGT T25C CGGA A0200400600800100012001400Sequence to analyze: YGYGGTGYGTATYGTTTGYGATSequence to analyze: YGYGGTGYGTATYGTTTGYGATDispensatio

3、nDispensationOrder:Order:48%47%45%45%探针技术的常见应用ARMs液相芯片基因芯片荧光PCR引物数量2222探针SybGreen引物固定于磁珠的探针固定于玻片探针荧光探针信号捕捉CCDCCD扫描仪或肉眼CCD判读光信号的有无光信号的有无探针技术Taqman 野生型的序列为 TTGTGGTAGTTGGAGCTGG 12ASP突变型（ARMS）引物P1 TTGTGGTAGTTGGAGCTGA 12ASP突变型（ARMS）引物P2 TTGTGGTAGTTGGAGCTCA 12ASP突变型（ARMS）引物P3 TTGTGGTAGTTGGAGCAGA探针法的案例探针法的

4、案例ARMS图1 3条ARMS引物的扩增曲线（模板为3*108 copies/ul野生型质粒）图2 3条ARMS引物的扩增曲线（模板为3*108 copies/ul突变型质粒）基因突变检测技术对比基因突变检测技术对比性能性能测序技测序技术术探针探针DHPLC荧光荧光PCR基因芯基因芯片片 悬液芯片悬液芯片ARMS检测通量检测通量高高低低高高高高低低高高灵敏、准确度灵敏、准确度高高高高一般一般高高一般一般高高重复性重复性好好好好一般一般好好好好好好可否定量可否定量是是否否是是是是否否否否技术可靠性技术可靠性金标准金标准/基因突变检测技术对比 金标准（Golden standard）在检测中的作用

5、： 现有技术所能达到的最先进水平，最接近客观事实，或者反映的就是客观事实本身； 如同病理诊断；为什么测序是金标准？ 人类基因组计划（human genome project, HGP ）； 1990年正式启动人类基因组测序计划, 2003年完成。 识别人类基因组的所有大约3万个DNA 测定组成人类基因组DNA的约30亿对核苷酸的序列 基因测序技术的进展基因测序技术的进展Sanger法第一代测序1977年简单、快捷现代测序法第二代测序实时检测费用更低通量更高速度更快第二代测序技术第二代测序技术o第二代测序技术的核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的第二代测序技术的核心思想是边合成边测序，即通

6、过捕捉新合成的末端的标记来确定末端的标记来确定DNADNA的序列，现有的技术平台的序列，现有的技术平台: :第二代测序技术Roche/454 FLXIllumina AB SOLID system测序片段比较长，高质量的读长能达到400bp测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%测序应用的新高度 对定性检测（Qualitative test ）进行定量分析（Quantitative Test ）；突变定量检测的必要性 突变负荷（mutational load ）； 疾病不同阶段（stage of disease）； 对应的

7、策略不同； 准确度高准确度高 灵敏度高灵敏度高 相对定量判读相对定量判读可检测3%的突变野生型突变型302060501010040908070基因所占比例灵敏度：3%灵敏度：灵敏度：30%30%PCR扩增PCR amplification2h测序样本准备Sample preparation15minDNA提取DNA purification2hPyro测序Pyrosequencing10-100min结果分析Genotyping and identification收取样本：血样或组织基因表达水平的检测 检测mRNA的水平；基因表达水平的检测技术 mRNA的降解； 20时，Y=0.62-0.0

8、04X（R=-0.981，P0.001）； 15时，Y =0.965-0.001X（R=-0.709，P0.001）； Y：18sRNA含量 X：离体时间 对标本位置的要求； mRNA表达水平是相对定量mRNAmRNA差异表达的相对定量分析差异表达的相对定量分析两种相对定量的分析方法：双标准曲线法和Delta-delta Ct法。基因修饰的检测DNA甲基化修饰： 基因甲基化的检测意义基因甲基化检测的意义 目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。这是因为人们发现肿瘤的发生与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭非常可能有关。o甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测o肿瘤的分级o甚至可以作为患病风险预测、临床病程监控和疗效评估的指标。焦磷酸检测基因甲基化甲基化程度的量化无法定量的甲基化检测基因突变检测技术测序测序探针探针质谱质谱原始信号原始信号光光光一级信息一级信息探针结合分子量二级信息二级信息序列是否改变分子大小是否改变推论推论推论推论最终信息最终信息 碱基序列是否改变碱基序列是否改变