PCR技术原理简介2013

1、2021/8/512013/3/212021/8/52 PCR是由美国科学家Kary B. Mullis 2021/8/53目录目录 基本原理基本原理12 PCR反应体系反应体系3 PCR的应用的应用4实验流程实验流程2021/8/54基本原理基本原理n聚合酶链反应聚合酶链反应（ polymerase chain reactionPCR ）：简称）：简称PCRPCR技术，是一种体外扩增特异性技术，是一种体外扩增特异性DNADNA片段的技术，其基本工作原理是以拟扩增的片段的技术，其基本工作原理是以拟扩增的DNADNA分子分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为为模板，以一对分别与模板互补

2、的寡核苷酸片段为引物，在引物，在DNADNA聚合酶的作用下，通过变性聚合酶的作用下，通过变性- -复性复性- -延伸延伸的循环操作，在体外迅速将的循环操作，在体外迅速将DNADNA模板大量扩增。模板大量扩增。 一、基本原理一、基本原理2021/8/55变性变性(denaturation):(denaturation):通过加热使通过加热使DNADNA双螺旋双螺旋氢键断裂，双链解离成单链氢键断裂，双链解离成单链DNADNA模板模板基本原理基本原理2021/8/56退火退火（annealingannealing）: :当温度降低时由于模板分子结当温度降低时由于模板分子结构较引物复杂得多，而且反应体

3、系中引物构较引物复杂得多，而且反应体系中引物DNADNA量大大多于模量大大多于模板板DNADNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNADNA双链之间互补的机会较少双链之间互补的机会较少Primer 1Primer 253553533基本原理基本原理2021/8/57延伸延伸(extension):(extension):在在DNADNA聚合酶和聚合酶和4 4种脱氧核糖核酸底物种脱氧核糖核酸底物及及MgMg2+2+存在的条件下，存在的条件下，5 35 3的聚合酶催化以引物为起始的聚合酶催化以引物为起始点的点的DNADNA链延伸反应。链延

4、伸反应。Primer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase基本原理基本原理2021/8/58PCRPCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C基本原理基本原理2021/8/591 1个个 PCR PCR 循环完成后得到循环完成后得到2 2个拷贝的靶序列个拷贝的靶序列基本原理基本原理2021/8/510n n次循环后靶序列扩增的数量为次循环后靶序列扩增的数量为2 2n n循环次数循环次数DNA扩增数扩增数12243841653230230n2 2n n基本原理基本原理2021/8/511二、二、PCRPCR反应体系反应体系PCR

5、PCR反应五要素：反应五要素：特异性寡核苷酸引物（特异性寡核苷酸引物（PrimerPrimer）耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶 （Taq DNA polymeraseTaq DNA polymerase） dNTP dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTPdATP,dGTP,dCTP,dTTP） DNADNA模板（模板（TemplateTemplate） 反应缓冲液（反应缓冲液（Reaction buffer）反应体系反应体系2021/8/512（一）寡核苷酸引物（一）寡核苷酸引物引物是引物是PCRPCR特异性反应的关键；特异性反应的关键；PCR PCR 产物的特异性取决于引物与模

6、板产物的特异性取决于引物与模板DNADNA互补的程度；互补的程度；理论上，只要知道任何一段模板理论上，只要知道任何一段模板DNADNA序列，就能按其设计序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用互补的寡核苷酸链做引物，用 PCRPCR就可将模板就可将模板DNADNA在体外在体外大量扩增。大量扩增。反应体系反应体系2021/8/513引物设计的原则：引物设计的原则：1.1. 引物应在核酸序列保守区内设计并具有特异性：引物与引物应在核酸序列保守区内设计并具有特异性：引物与非特异性扩增序列的同源性不要超过非特异性扩增序列的同源性不要超过70%70%或有连续或有连续8 8个互补个互补碱基同源。碱基同

7、源。2. 2. 产物不能形成二级结构：某些引物无效的主要原因是产物不能形成二级结构：某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。二级结构区域。3. 3. 引物长度一般为引物长度一般为 15-30bp15-30bp左右。引物的有效长度不能左右。引物的有效长度不能大于大于 38 38 ，否则最适延伸温度会超过，否则最适延伸温度会超过TaqDNATaqDNA聚合酶的最适聚合酶的最适温度（温度（7474），不能保证），不能保证PCRPCR扩增产物的特异性。引物过扩增产物的特异性。引物过短也会使特异性降低。短也

8、会使特异性降低。反应体系反应体系2021/8/514引物设计的原则：引物设计的原则：引物碱基：引物碱基：G+CG+C含量以含量以40-60%40-60%为宜，为宜，G+CG+C太少扩增效果不太少扩增效果不佳，佳， G+C G+C 过多易出现非特异条带。四种碱基分布最好过多易出现非特异条带。四种碱基分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。TmTm值最好接近值最好接近7272：以使复性条件最佳。：以使复性条件最佳。TmTm一般低于有一般低于有效启动温度效启动温度510510，也可按公式，也可按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)Tm=4(G+C)+2(A

9、+T)估计估计TmTm值。值。碱基要随机分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，尤其碱基要随机分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，尤其是是33端不应超过端不应超过3 3个连续的个连续的G G或或C C。4.4.引物自身不能有连续引物自身不能有连续4 4个碱基互补，否则引物自身会折个碱基互补，否则引物自身会折叠成发夹结构影响引物本身复性。叠成发夹结构影响引物本身复性。反应体系反应体系2021/8/515 引物设计的原则：引物设计的原则：8. 8. 引物之间不能有连续引物之间不能有连续4 4个碱基互补，避免两条引个碱基互补，避免两条引 物间互补，物间互补， 特别是特别是 33端的互补，否则会形成引物端的互

10、补，否则会形成引物 二聚体，产生非特异性的扩增条带。二聚体，产生非特异性的扩增条带。9. 9. 引物的延伸从引物的延伸从33端开始，端开始，33端不可修饰，而端不可修饰，而 引物引物55端可以修饰，如加酶切位点、标记生物端可以修饰，如加酶切位点、标记生物 素、引入突变位点等。素、引入突变位点等。10.10.引物引物 33端的碱基要求严格配对端的碱基要求严格配对 特别是最末及特别是最末及 倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导 致致PCRPCR失败。失败。切位点切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好，这对酶切分析或分子克隆很有好处处反应体系反应体系20

11、21/8/516反应体系反应体系引物量：引物量：PCRPCR反应中引物的浓度一般为反应中引物的浓度一般为0.2 1umol0.2 1umol，以最低引物，以最低引物量产生所需要的结果为好。引物浓度偏高会引起错配和量产生所需要的结果为好。引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会的机会2021/8/517（二）耐热（二）耐热DNADNA聚合酶聚合酶Taq DNATaq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌聚合酶是从一种水生栖热菌yT1yT1株分离提取的，株分离提取的，Taq DNATaq DNA聚合酶它的最适反应温度在聚合酶它的最适反

12、应温度在7575左右，在左右，在9595的高温具有良好的热稳定性。的高温具有良好的热稳定性。在在100ul PCR100ul PCR反应体系中。一般约需加入酶量反应体系中。一般约需加入酶量 2-4U2-4U，足以达到每分钟延伸足以达到每分钟延伸1000-40001000-4000个核苷酸的速度。个核苷酸的速度。浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。量减少。 Taq DNATaq DNA聚合酶具有聚合酶具有5 35 3聚合酶活性和聚合酶活性和5 5 33外切酶活性，而无外切酶活性，而无3 53 5外切活性，因而没外切活性，因而没有校正

13、功能，碱基配错率为有校正功能，碱基配错率为2.1 2.1 1010-4-4 。反应体系反应体系2021/8/518（三）（三）dNTPdNTP在在PCRPCR反应中，反应中，dNTPdNTP应为应为 5050200umol/L200umol/L，尤其是注意，尤其是注意4 4种种dNTPdNTP的浓度要相等（等摩尔配制的浓度要相等（等摩尔配制 ），）， 如其中任何一种浓如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过高可加速反应速度，同时增加碱基的掺入率和实验浓度过高可加速反应速度，同时增加碱基的掺入率和实验成本，浓度过低又会

14、降低反应速度，但可提高实验的精准成本，浓度过低又会降低反应速度，但可提高实验的精准性。性。反应体系反应体系2021/8/519（四）模板（靶基因，（四）模板（靶基因，target genetarget gene）PCRPCR对模板的要求不高，单、双链对模板的要求不高，单、双链DNADNA均可作为模板用于均可作为模板用于PCRPCR反应。但为了保证反应的特异性，一般还宜用微克水反应。但为了保证反应的特异性，一般还宜用微克水平的基因组平的基因组DNADNA或或10104 4拷贝的扩增片段作为起始材料。拷贝的扩增片段作为起始材料。反应体系反应体系2021/8/520（五）反应缓冲液（五）反应缓冲液P

15、CRPCR缓冲液为反应提供所必须的合适的酸碱度和某些离子，缓冲液为反应提供所必须的合适的酸碱度和某些离子，目前最常用的缓冲液是目前最常用的缓冲液是10-50mmol/L10-50mmol/L的的Tris-HClTris-HCl。 Tris-HCl Tris-HCl 10-25mmol/L10-25mmol/L KCl KCl 50mmol/L50mmol/L MgCl MgCl2 2 1.5mmol/L1.5mmol/L 明胶或牛血清白蛋白明胶或牛血清白蛋白 100ug/ml100ug/mlMgMg2+2+对对PCRPCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的扩增的特异性和产量有显著的影响，

16、在一般的 PCRPCR反应中，各种反应中，各种NTPNTP浓度为浓度为200umol/L200umol/L时，时，MgMg2+2+浓度为浓度为1.51.52.0 mmol/L2.0 mmol/L为宜。为宜。MgMg2+2+浓度过高反应特异性降低，出现非特浓度过高反应特异性降低，出现非特异扩增；异扩增； 浓度过低会降低浓度过低会降低 Taq DNATaq DNA聚合酶的活性，使反应聚合酶的活性，使反应产物减少。产物减少。KClKCl有利于引物与模板退火有利于引物与模板退火反应体系反应体系2021/8/521三、PCR实验流程 标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系1010扩增缓冲液扩增缓冲液

17、10ul10ul 4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L 引物引物 1010100pmol100pmol 模板模板DNA DNA 0.10.12ug2ug Taq DNA Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u2.5u Mg Mg2+2+ 1.5mmol/L1.5mmol/L 加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ul100ulPCRPCR流程流程2021/8/522循环参数设置：循环参数设置：PCRPCR流程流程一般一般939394 lmin94 lmin足以使模板足以使模板DNADNA变性。变性变性。变性 温度低，解链不完全是导致温度低，解链不完全是导

18、致PCRPCR失败的最主要原因失败的最主要原因。若温度过低，变性不完全，会减少产量；若温度过低，变性不完全，会减少产量；但温度过高或反应时间过长，会导致酶活性的损失，但温度过高或反应时间过长，会导致酶活性的损失，Taq DNATaq DNA聚合酶半寿期：聚合酶半寿期：92.592.5 2h2h以上，以上，9595 40min40min，9797 5min5min。TmTm值值=4=4（G+CG+C）2 2（A+TA+T），复性温度），复性温度=Tm-=Tm-（5-105-10）。一般为）。一般为40-6040-60，复性时间，复性时间30-60s30-60s。 在在TmTm值允许范围内，值允许

19、范围内，增加温度能减少引物与模板的非特增加温度能减少引物与模板的非特异性结合异性结合; ;降低温度可增加反应的灵敏性。降低温度可增加反应的灵敏性。 2021/8/523延伸温度一般选择延伸温度一般选择70-75,70-75,常选常选7272，过，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间根据待扩增片段长度而定：根据待扩增片段长度而定：1Kb1Kb以内的以内的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min1min3 34kb4kb的靶序列需的靶序列需3 34min4min扩增扩增10Kb10Kb需延伸至需延伸至15min15min延伸进间过长会导致非特异性扩增延伸进间过长会导致非特异性扩增主要取决于模版主要取决于模版DNADNA的浓度，一般为的浓度，一般为25-3025-30次之间。循环次数越多，非特异性产物的量亦随次之间。循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。之增多。PCRPCR流程流程2021/8/5241234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链