第三节微生物的人工培养技术

1、【最新卓越管理方案您可自由编辑】（生物科技行业）微生物2020年5月多年的企业咨洵顾问屋侬,经过实战验证可以落地执i亍的卓越管理方窠，值得您下我拥有第三节微生物的人工培养技术培养原则： 细胞型微生物使用体外培养基进行培养。病毒使用活细胞进行培养。操作原则：无菌操作培养条件：需氧培养、微需氧培养和厌氧培养。培养方式：分离培养和纯培养第六章微生物的生态微生物的生态 ?是研究微生物与环境间相互作用关系的科学.包括三大研究内容 :第一节微生物在自然界的分布第二节环境因素对微生物的影响第三节微生物在物质循环中作用（自学）学习要点：1. 掌握反刍兽瘤胃中微生物种类与作用；2. 掌握正常菌群的作用；3. 掌

2、握常用的消毒灭菌方法。第一节微生物在自然界分布一、正常动物体的微生物分布二、正常菌群及其作用三、空气中微生物的分布（自学）四、土壤中微生物的分布（自学）五水中微生物的分布（自学）反刍兽瘤胃中微生物种类与数量厌氧菌-109-1011 个/g内容物厌氧真菌-105个/g内容物纤毛虫-105-106个/g内容物瘤胃内厌氧菌纤维素分解菌半纤维素分解菌蛋白质合成菌蛋白质分解菌脂肪分解菌淀粉分解菌维生素合成菌产甲烷菌瘤胃微生物的作用肠道中微生物粪便中微生物真杆菌腐败菌双歧杆菌酵母肠球菌霉菌拟杆菌嗜热菌大肠杆菌等放线菌等分解纤维素使非反刍分解粪便中纤维素，兽部分利用粗纤维，转化为优质粪肥合成挥发性脂肪酸。二

3、、正常菌群（ normalflora）1. 正常菌群是指动物体某些部位恒定发现的微生物群体.异常情况下，正常菌群与动物体间的平衡受到破坏，正常菌群的种类和数量改变，潜在病原微生物迅速繁殖而引起菌群失调症。长期大量使用抗生素治疗，杀灭大量敏感菌，使某些条件致病菌或耐药菌优势生长，因感染及慢性消耗性疾病 ,使动物免疫功能低下。长期给动物饲喂单一饲料或急剧改变饲料配方或动物过度使役、长途运输。第二节环境因素对微生物的影响重要概念消毒 （ disinfection ） 是指用化学或物理方法杀灭物体上病原微生物的方法。而对非病原微生物并不严格要求全部杀死。防止病原传播。防腐（ antisepsis ）是

4、指利用某种理化因素防止或抑制微生物生长繁殖的方法。防腐也称抑菌。防腐剂、低温、缺氧、干燥、高渗、高酸度等措施。无菌（ asepsis ） ：不含活菌的意思。无菌法：防止任何微生物进入人和动物机体或其它物品的方法，其操作方法叫无菌操作或无菌技术。抗菌作用（ antibacterialaction ） ：是抑菌和杀菌作用的总称。影响因素物理因素化学因素生物因素物理因素干燥温度渗透压辐射过滤干燥（一）干燥对微生物的影响干燥死亡休眠（二）干燥控制微生物的实际应用1. 物品的干燥保存：饲料、肉类食品晒干、风干、烘干2. 菌种的干燥保存：温度1 低温低温有抑菌作用，被广泛用于保存食品、菌种和毒种。数月数年

5、，毒力与抗原性等基本不变。冷冻可杀死部分微生物。 why ？低温胞内水分外溢，电解质浓缩和蛋白质变性。冰晶破坏原生质的胶体状态和机械损伤细胞膜。冰晶当样品冷冻时， 其细胞内液开始凝固时的温度，称为“冷冻点”，含水量 80 的细胞约为-30 。经逐渐冷却，水份就慢慢形成冰晶。如果冰晶太大就会使细胞变形移位，但到低于 -80 的超冷冻期浸泡法(immersion)-物品消毒擦拭法(rubbing)- 污染物表面或皮肤消毒喷雾法(nebulization)-地面、墙壁、环境消毒熏蒸法(fumigation)-室内空气消毒抗微生物药物一、抗生素二、溶菌酶三、抗体和疫苗四、干扰素五、抗微生物的中草药抗生

6、素是某些微生物合成或半合成的能抑制或杀死另外一些微生物的一类化合物。它主要来源于放线菌，少数来源于某些真菌和细菌等。抗菌作用机制 :1. 抑制细胞壁合成2. 破坏细胞膜通透性3. 抑制蛋白质合成4. 干扰核酸合成3. 生物因素1. 互生互生是指两种可以单独生活的生物，当它们生活在一起时，通过各自的代谢活动而有利于对方的相互关系。2. 共生共生是指两种生物专性共居在一起，相互分工协作，达到难分难解、合二为一的相互关系。往往生理上相互分工，组织上形成了新结构豆科植物和根瘤菌共生形成根瘤根瘤菌在根皮层细胞内获得营养生长繁殖；皮层细胞受细菌分泌物的刺激， 迅速分裂产生大量新细胞，使皮层体积膨大和凸出，

7、形成根瘤。3. 拮抗拮抗是指一种生物在其生命活动过程中，产生某种代谢产物或改变环境条件，从而抑制或杀死它种生物的现象。4. 寄生寄生是指一种生物生活在另一种生物体内或体表，从中获得营养并对后者造成损害作用。前者为寄生虫，后者为寄主。第 6 章微生物的遗传变异学习内容 :第一节遗传变异的物质基础第二节变异现象第三节变异机制第四节变异株的获得与应用第五节菌种退化、复壮和保藏时，就发展到“再结晶点”。超过此点以后，就不形成冰晶。冷冻的细胞内液成为均匀的玻璃状。冷冻保护减少冰晶形成速冻保护剂,形成均一的玻璃结晶,不造成损害。冷冻真空干燥法，保护剂，对微生物损害更小。反复冻融，对微生物更具有破坏力。可以

8、制备菌体裂解液。高温超过微生物生长的最高温度 :酶变性失活,代谢停滞,DNA 断裂 ,核糖体解体和蛋白质变性或凝固,导致微生物死亡。大多数细菌、病毒、酵母菌和丝状真菌营养体的热毙点为50 -65 Co细菌芽孢的抗热力极强，能耐100 ， 2h 以上巴氏消毒 低温： 63-65 30min71-72 15s>132 >1-2s高压蒸汽灭菌法 压力逐渐增大，温度也随之升高121.3 ,15-30min渗透压高渗环境中微生物发生质壁分离现象而抑杀菌。低渗环境中微生物发生胞浆压出现象而杀菌日光、辐射1. 可见光：波长为 400 800nm有利：是光能自养和光能异养型微生物的唯一或主要能源。

9、不利：强烈的可见光由于光氧化作用对微生物有伤害作用。2. 日光和紫外线强烈日光：杀菌作用，主要是紫外线。紫外线：136400nm ,波长 200300nm 的对微生物有致死效应。紫外线杀菌原理：干扰 DNA 的复制臭氧空气灭菌，每10m2安装30 W紫外线灯管一支，有效距离不超过2 m,杀菌时间30-60min ；用于物品杀菌，有效距离为 25-60cm ；杀菌时间为20-30min 。3. 化学因素化学药剂：分为杀菌剂、消毒剂、防腐剂。1. 杀菌剂能杀死一切微生物及其孢子的药物；2. 消毒剂指能迅速杀死病原微生物的药物；3. 防腐剂指能抑制微生物生长繁殖的药物。化学治疗剂：主要用于人和动物疾

10、病的预防或治疗化学消毒剂的使用方法学习要点 :掌握微生物的遗传物质、 常见变异现象和变异机制。概念状保持相对稳定，是各种微生物存在的根据。是微生物得以发展进化。微生物的各种性状受相应基因的控制。2. 质粒是存在于细菌等微生物染色体以外的小型闭合环状双链 DNA 。具有以下特性 ：特殊功能性转移性丢失性基因工程的载体特殊功能性F 质粒（FertilityPlasmid） ：编码性菌毛，控制细菌的接合。R 质粒（ResistancePlasmid）： 编码抗性因子,使细菌对某种抗菌素产生抗性。Vi 质粒：编码毒素，使细菌具有致病性。代谢质粒：编码代谢酶,调节细菌代谢。3. 转位因子是存在于染色体或

11、质粒 DNA 分子上的一段核苷酸片段，它们能在 DNA 分子中移动，不断改变其在基因组或质粒中的位置。 4. 微生物遗传变异的特点1）微生物遗传物质多样化 2）微生物容易发生变异：赖以生存的条件第二节微生物的变异现象一、形态变异二、特殊结构变异四、毒力变异毒力 :系指同一种病原微生物不同分离株的病原性在程度上的差别。是衡量病原微生物致病力大小的指标。（强毒株、中等毒力株、弱毒株）包括：侵袭力、毒素侵袭力：病原微生物在机体内定殖、突破机体的防御屏障，侵入组织或细胞，在其中生长繁殖，并能深入扩散的能力。毒素：某些细菌能产生一类对机体有毒性的物质：内毒素、外毒素外毒素：某些病原菌（主要 G+ ）在生

12、长繁殖过程中产生并分泌到菌体外的有毒性的蛋白质。内毒素：G-菌细胞壁最外层的结构成分（LPS）,在细菌死亡 后释放出来。毒力变异是指毒力由强变弱或由弱变强。毒力变异具有重要意义。五、耐药性变异是指微生物由原来对某种药物敏感转为不敏感。耐药性产生的诱因1. 不分情况，乱用抗生素；2. 剂量不足或过大，滥用抗生素；3. 将抗生素用作畜禽生长剂长期使用。药物敏感试验方法1. 药敏纸片扩散法通过测定抑菌圈大小定性分析细菌对药物的敏感程度第三节微生物的变异机制一、基因突变即 DNA 分子中结构中一对或几对碱基发生了改变。二、基因重组二个性状不同微生物的基因组进行交换、重新组合形成具有杂交性状的子代微生物

13、。1） 转化是指供体菌的游离DNA 片段被受体菌摄取，使受体菌获得新的遗传性状。2）转化条件受体菌与供体菌具有同源性；游离 DNA 片段大小适宜（十几个基因） ；受体菌细胞处于感受状态。2. 转导 是以噬菌体为载体，将供体菌DNA 片段转至受体菌内，使受体菌获得新遗传性状。3. 接合 接合是指受体菌与供体菌直接接触，供体菌通过其性菌毛将 DNA 片断传给受体菌,使受体菌获得新遗传性状。真菌1. 有性生殖是指性细胞间的接合、染色体重组，产生新遗传型后代的过程。2. 准性生殖是通过两个不同体细胞发生融合、有丝分裂而导致低频率的基因重组过程。病毒1. 核酸非节段病毒- 分子内重组2. 核酸分节段病毒

14、- 分子间重配3. 病毒的基因重组可发生在：异种病毒之间同种病毒之间同株病毒之间（可能出现多数感染复活现象）灭活病毒和活病毒之间（可能出现交叉复活现象）多数感染复活现象（ multiplicityreactivation ）是指以同株灭活病毒大量感染细胞时，可能会产生感染性病毒的现象。可能机理？危害性？病毒灭活苗交叉复活现象( crossreactivation )是指一种活病毒与另一种灭活病毒混合感染细胞时，由于基因重组，使子代病毒获得灭活病毒的某一性状。一、变异株获得的方法自然筛选法 1/104-1/109 人工诱变法1/10-1/106原生质体融合技术基因工程技术二、人工诱变- 紫外线诱

15、变法暗室中将菌体直接暴露于紫外灯下照射，照射距离为 20-30cm ， 照射剂量以使70%-80% 微生物发生死亡为准。二、人工诱变- 生物学诱变法将微生物强毒株在非易感动物体内或非易感细胞内反复传代，使强毒株转化为弱毒株。卡介苗猪瘟兔化弱毒苗三、原生质体融合技术1. 原生质体是指除去细胞壁的微生物细胞。2. 原生质体融合技术是通过人为方法将遗传性状不同的两个微生物细胞原生质体发生融合，进而发生基因重组 ,以产生同时带有双亲性状、 遗传稳定融合子的技术。3. 该技术的最大优点是微生物可在不同种属间进行杂交。四、基因工程技术基因工程技术的工具将目的基因片断从供体细胞内提取，需要基因的剪刀限制性内切酶将目的基因与载体连接， 需要基因的针线 DNA连接酶将目的基因运入受体细胞，需要基因的运输工具载体五、微生物变异株的应用1. 在饲料和畜产品发酵中通过改良生产菌种特性，提高产品的产量和质量。2. 缺失病原微生物的毒力基因获得无毒株或弱毒株，用于制备疫苗，预防传染病。第五节菌种退化、复壮和保藏一、菌种