保护碱基添加总结

1、酶切位点保护碱基表61寡校昔酸序列切割率2 hr20 hriPvu ICCGATCGG00ATCOATCGAT1025TCGCGATCQCOA0101Sac ICGAGCTCO1010厂Sac IIGCCGCGGC00TCCCCGCGGQGA50>901Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC00GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCG1050GACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA1075Sea IGAGTACTC1025AAAAOTACTTTT7575iSma ICCCGOG010CCCCQGGQ010CCCCCG

2、GGGG1050TCCCCCGQQGQA>90>90ISpe IGACTAQTC10>90GGACTAGTCC10>90COGACTAGTCCG050CTAGACTAGTCTAG050%寡核昔酸序列切割率2 hr20 hrNot ITTGCGGCCGCAA00ATTTGCGGCCGCTTTA1010AAATATGCGGCCQCTATAAA1010ATAAGAATGCGGCCQCTAAACTAT2590AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAQGAAAA25>90NsilTOCATQCATGCA10>90CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT>

3、90>90Pac ITTAATTAA00QTTAATTAAC025CCTTAATTAAGQ0>90Pme IGTTTAAAC00GGTTTAAACC025QGQTTTAAACCC050AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG75>90Pst IQCTGCAOC00TGCACTGCAGTOCA1010AACTGCAGAACCAATOCATTQQ>90>90AAAACTGCAGCCAATQCATTGGAA>90>90CTGCAGAACCAATGCATTGGATQCAT00Pvu ICCGATCGG00ATCGATCGAT1025TCGCGATCGC

4、GA010Sac ICGAGCTCO10101Sac IIGCCGCGQCTCCCCGCQGGQA0500>901SallGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC00GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCG1050GACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA1075厂Sea IGAGTACTC1025AAAAOTACTTTT7575iSma ICCCGGG010CCCCGGGG010CCCCCGGGGG1050TCCCCCGQQGQA>90>901Spe IGACTAQTC10>90GGACTAGTCC10>

5、90COGACTAQTCCG050CTAGACTAGTCTAG050I-Sph IQGCATGCC00CATGCATOCATG025ACATGCATGCATOT10501Stu IAAGGCCTT>90>90GAAGGCCTTC>90>90AAAAQGCCTTTT>90>901XbalCTCTAGAG00GCTCTAGAQC>90>90TGCTCTAGAGCA75>90CTAGTCTAGACTAG75>901Xho ICCTCGAGG00CCCTCGAGQQ1025CCQCTCGAGCGG10751Xma ICCCCGGGG00CCC

6、CCGGGGG2575CCCCCCGGGGGG50>90TCCCCCCGGGGGGA>90>90酶寡核昔酸序列切割率2 hr20 hrAcc IGGTCGACC00CGGTCGACCG00CCGGTCGACCGG00Afl IIICACATGTG00CCACATGTGG>90>90CCCACATGTGGG>90>90Asc IGGCGCGCC>90>90AGGCGCGCCT>90>90TTGGCGCGCCAA>90>90Ava ICCCCGGGG50>90CCCCCGGGGG>90>90TCCCCC

7、GGGGGA>90>90BamH ICGGATCCG1025CGGGATCCCG>90>90CGCGGATCCGCG>90>90Bgl IICAGATCTG00GAAGATCTTC75>90GGAAGATCTTCC25>90BssH IIGGCGCGCC00AGGCGCGCCT00TTGGCGCGCCAA50>90BstE IIGGGT(A/T)ACCC010BstXIAACTGCAGAACCAATGCATTGG00AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA2550CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT25>90C

8、lalCATCGATG00GATCGATC00CCATCGATGG>90>90CCCATCGATGGG5050EcoR IGGAATTCC>90>90CGGAATTCCG>90>90CCGGAATTCCGG>90>90Hae IIIGGGGCCCC>90>90AGCGGCCGCT>90>90TTGCGGCCGCAA>90>90Hind IIICAAGCTTG00CCAAGCTTGG00CCCAAGCTTGGG1075Kpn IGGGTACCC00GGGGTACCCC>90>90CGGGGTACCCC

9、G>90>90Mlu IGACGCGTC00CGACGCGTCG2550Neo ICCCATGGG00CATGCCATGGCATG5075PCR引物设计原则信息来源：本站原创 更新时间：2004-12-21 0:44:00PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核茸酸片段，使其能有 效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特 异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的 片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要 避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 现在可以在这一保守区域里设计一对引物。

10、一般引物长度为1530 碱基，扩增片段长度为100600碱基对。让我们先看看Pl引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%60%。 而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚瞟吟或聚唏噪存在。否则 P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连 续碱基的互补。引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的宁 端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特 异性影响不大。但3,端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是 从3端开始的。这里还需提醒的是3端不要终止于密码子的第3 位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特

11、异性与效率。综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则： 引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构。 弓I物长度一般在1530碱基之间。 G+C含量在40%60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 弓I物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物5'端可以修饰。 引物3,端不可修饰。 引物3,端要避开密码子的第3位。PCR引物设计的目的是找到一对合适的核昔酸片段，使其能有效 地扩增模板DNA序列。如前述，弓I物的优劣直接关系到PCR的特 异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保 PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设

12、计。1引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱 基同源。2. 避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择 扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计 mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自 由能（AG。）小于58.61kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能 避开这一区域时，用7-deaza-2 * -脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。3. 长度寡核苜酸引物长度为1530bp, 般为2027mero引物的有效长 度：Ln=2 (G+C) + (A+T+, Ln值不能大于38

13、,因为38时，最 适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74£),不能保证产 物的特异性。4. G+C含量G+C含量一般为40%60%。其Tin值是寡核昔酸的解链温度，即 在一定盐浓度条件下,50%寡核昔酸双链解链的温度,有效启动温度, 一般高于Tni值510°Co若按公式Tm=4 (G+C) +2 (A+T)估计 引物的Tni值，则有效引物的Tm为5580£,其Tni值最好接近 72°C以使复性条件最佳。5. 碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嗥吟或聚喀噪的存在。 尤其3端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C

14、富 集序列区错误引发。6. 引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引 物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结 合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。7. 引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚 体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。8. 引物的V端引物的延伸是从V端开始的，不能进行任何修饰。3#端也不能有 形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR （AS-PCR）反应中，引物 3'端不能发生错配。在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800pmol/L dNT

15、P （四种dNTP各200pmol/L）以质粒（103拷贝）为模板， 按 95°C,25s; 55cC,25s; 72°C, lmin 的循环参数扩增 HIV-l gag 基因区的条件下，引物3,端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A : A错配使产量下降至1/20,A : G和C : C错七下降至l/100o 引物A:模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。9. 引物的5'端引物的宁 端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物宁端修饰包括：加 酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合

16、 DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序 列等。10. 密码子的简并如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子 的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。特殊目的的引物设计将在有关章节讨论。随着人们对引物的认识，一 些引物的计算机设计程序也应运而生，下面将讨论有关引物计算机设 计方法。翱妙NAW飙） 鋼0础 逆竹野喙翹的临TO碾5IWMOT?K或试i刼并彌朋只艄附；肝戢瞰,PC胎前稠湘于爵GC曲勵ThmlA淞有卿0Eb喋狮卿姗A 口 uPnm呵以期逼PCR参数设定的基本原则一个PCR反应开始，首先是双链DNA解离为单链，使之有利于与引物结 合过

17、程可以通过加热来完成。在90-95°C条件下，即使复杂的DNA分 子，如人基因组DNA也可变性成单链，根据模板DNA复杂程度，可以调 整变性温度和时间。一般情况下选择94 'C、30s可使各种复杂DNA分 子完全变性。过高温度或持续时间过长，对TaqDNA聚合酶活性和dNTP 分子都会造成损害。变性后的DNA很快冷却至40609,即可使引物和模板DNA发生结合。 这是由于模板DNA结构比引物复杂得多，引物和模板之间碰撞的机会大 大高于模板互补链之间的碰撞。复性温度的选择，可以根据引物的长度和 其G-+-C含量确定。引物长度为1525bp时，退火温度可通过Tm = 4X(G+C)+2X (Ad-T)计算得到。在Tm允许的温度围，选择较高的退火温 度可大大减少引物和模板之间的非特异结合，提高PCR的特异性。退火时间设置为30s,足以使引物和模板之间完全结合。 PCR反应的延伸温度为70759,此时,TmqDNA聚合酶具有最高活性。 引物在16个核昔酸以下时，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 可采用反