核酸序列分析

1、2021/8/21尹铁球尹铁球核酸序列分析核酸序列分析2021/8/222021/8/232021/8/24 ddNTPs are chain-terminating nucleotides: the synthesis of a DNA strand stops when a ddNTP is added to the 3 end2021/8/25The absence of 3-hydroxyl lead to the inefficiency of the nucleophilic attack on the next incoming substrate molecule.2021/8

2、/26 生合成核酸定序法的反生合成核酸定序法的反应应 2021/8/272021/8/28If one ddGTP is added to 100 dGTP, DNA synthesis aborts at a frequency of 1/100 every time the polymerase meets a ddGTP Tell from the gel the position of each G2021/8/292021/8/210Sanger法第二步：荧光检测法第二步：荧光检测2021/8/211核酸核酸测测序原理序原理聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 T A G CTAGC

3、凝胶电泳凝胶电泳可以分可以分开开各各种种不同不同长长度度的核酸，在的核酸，在电泳胶电泳胶片依序排片依序排开开但但这样这样的的图谱图谱不能判別出不能判別出各核酸端各核酸端点点的核的核苷苷酸酸种类种类若能把尾端核若能把尾端核苷苷酸相同的片段酸相同的片段提出，跑在同一行，提出，跑在同一行，则则比比较这较这样样的四行，即可的四行，即可读读出序列。出序列。2021/8/212Four separate reactions dNTP+ ddGTP, dNTP+ ddATP dNTP+ ddCTP, dNTP+ ddTTPEach ddNTP carries a fluorescence group, al

4、lowing us to “Read” the sequence directly from the gel.DNA sequencing gel2021/8/21313Automatic sequencer Fluorescence Labeled ddNTP2. Polymerase catalyzed 2021/8/214DNADNA的测序仪示意图的测序仪示意图computer analysis2021/8/2152021/8/216引物标记法测序引物标记法测序(Dye Primer) 一个样本，一个样本，4个反应。个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜个反应中引物序列相同，

5、但分别标记有不同颜色的荧光。色的荧光。+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddATP (terminator)+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddCTP+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddGTP+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddTTP 反应结束后反应结束后，将，将4管反应液管反应液混合，经乙醇沉混合，经乙醇沉淀后上样淀后上样2021/8/2172021/8/218终止法测序终止法测序(Dye Ter

6、minator)一个样本，一个样本，1个反应。反应中包含分别带个反应。反应中包含分别带4色荧光标记的色荧光标记的ddNTP(终止子终止子)unlabeled primertemplate DNA+AmpliTaq FSdATP, dCTP, dGTP, dTTPddCTPddATPddGTPddTTP2021/8/2192021/8/220 Sanger法测序产物的平均链长取决于法测序产物的平均链长取决于ddNTP : dNTP的比例。测序反应试剂由测序试剂盒中提供，反应体系的比例。测序反应试剂由测序试剂盒中提供，反应体系可以根据实际情况调整，可以根据实际情况调整， 一般反应体系中一般反应体系

7、中dNTPs的浓的浓度远高于度远高于ddNTPs（一般（一般1 : 34） ，比例高时，得到较，比例高时，得到较短的产物。短的产物。 如果将待测如果将待测DNA片断克隆在质粒载体上，利用引物步片断克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从移延伸，从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定，直片断的一端开始逐步进行序列测定，直至另一端为止。克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆至另一端为止。克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备步骤，也减轻了数据分析工作量。需要先知道上游制备步骤，也减轻了数据分析工作量。需要先知道上游序列的碱基顺序，才能合成适当的引物进行测序。序列的碱基顺序，才能合成适当的引物进行测序。

8、2021/8/221 高通量测序技术又称“下一代”测序技术（Next-generation sequencing technology），能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。 该系统的测序原理是在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以对DNA序列进行实时测定。在测序时，使用了一种叫做“PTP”（Pico TiterPlate）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。 高通

9、量测序高通量测序（High-throughput sequencing）2021/8/222 测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。光信号实时被高灵敏度电荷耦合元件（Charge-coupled Device, CCD）捕获，通过对测序数据的分析，就可以准确、快速地测定模板的碱基序列。2021/8/223 测序反应可分为四个部分：测序反应可分为四个部分： 文库制备：将基因

10、组文库制备：将基因组DNA/cDNA片段化处理至片段化处理至400-800bp间，切割后的间，切割后的DNA经末端修复后，加上特定的共经末端修复后，加上特定的共同接头（同接头（adapter），回收单链的），回收单链的DNA（ssDNA）；）； PCR扩增：特定比例的单链扩增：特定比例的单链DNA文库被固定在特别文库被固定在特别设计的设计的DNA捕获磁珠上，使每颗珠子带有自己特有的单捕获磁珠上，使每颗珠子带有自己特有的单一的一的DNA片段，然后在倒入的含有片段，然后在倒入的含有PCR必需试剂的乳胶必需试剂的乳胶颗粒中，使每个独特的片断在自己的微反应器里进行独颗粒中，使每个独特的片断在自己的微反

11、应器里进行独立的扩增，而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响。立的扩增，而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段的扩增平行进行。扩增后产生了几百万个相同整个片段的扩增平行进行。扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，洗去乳胶物质，回收纯化磁珠上的片段；的拷贝。随后，洗去乳胶物质，回收纯化磁珠上的片段；2021/8/224 测序反应：将带有单链测序反应：将带有单链DNA的珠子与其他反应物混的珠子与其他反应物混合后放入合后放入PTP板（板（fibre-optic slide）中进行后继的测序。）中进行后继的测序。PTP孔的直径（孔的直径（29um）只能容纳一个珠子（）只能容纳一个珠子（20u

12、m）。）。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号，并被的信号，并被CCD照相机所捕获；照相机所捕获； 数据分析：通过测序系统提供的生物信息学工具对测数据分析：通过测序系统提供的生物信息学工具对测序数据进行分析。序数据进行分析。 与传统测序技术不同之处是，这种新型的测序方法不与传统测序技术不同之处是，这种新型的测序方法不需要对细菌进行亚克隆或者单个克隆处理，整个测序反需要对细菌进行亚克隆或者单个克隆处理，整个测序反应都是批量进行的，而且该技术不需要荧光标记的引物应都是批量进行的，而且该技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行

13、电泳。或核酸探针，也不需要进行电泳。2021/8/2252021/8/2262021/8/227焦磷酸测序法的原理及应用焦磷酸测序法的原理及应用 （Pyrosequencing）2021/8/228pyro=pyrophosphatepyro=pyrophosphate焦磷酸焦磷酸一种一种全新的全新的基于酶级联反应的基于酶级联反应的新型新型遗传分析技术遗传分析技术; ;一套完整的实验方案；一套完整的实验方案；诸多领域的广泛应用诸多领域的广泛应用 PyrosequencingPyrosequencingPyrosequencingPyrosequencing这项专利技术完全由这项专利技术完全由B

14、iotageBiotage公司拥有公司拥有2021/8/229PPiATPAPSLuciferin硫酸化酶硫酸化酶双磷酸酶双磷酸酶荧光素酶荧光素酶oxyluciferin2021/8/230lighttime2021/8/231 C G TT CC A CC T N 每次向反应体系中加入一种每次向反应体系中加入一种dNTPdNTPN 相应位置的峰代表该种相应位置的峰代表该种dNTPdNTP的掺入情况的掺入情况N 峰高与掺入的核苷酸数量成正比峰高与掺入的核苷酸数量成正比N 多余的多余的dNTPdNTP在加入下一种在加入下一种dNTPdNTP前就被降解前就被降解2021/8/232纯合子纯合子杂合子杂合子ACTGCCTGCTGCCTA/GCTGCCT2021/8/233C/CC/CT/TT/TG/GG/GC/TC/TC/GC/GT/GT/GGenotyping of tri-allelic SNP (C/T/G)Genotyping of tri-allelic SNP (C/T/G)2021/8/234FastAccuracyFlexibilityMultiplexingSimpleSequenceEfficientShort Optimization T