分子生物学讲座8

1、4、调控基因、调控基因调控基因调控基因(regulatorygene)是编码能与操纵子是编码能与操纵子序列结合的调控蛋白的基因。调控方式有负调控序列结合的调控蛋白的基因。调控方式有负调控(negativeregulation)和正调控和正调控(positiveregulation)。某些特定的物质能与调控蛋白结合，使调控蛋某些特定的物质能与调控蛋白结合，使调控蛋白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录的影响，这些特定物质中凡能引起诱导发生的分的影响，这些特定物质中凡能引起诱导发生的分子称为诱导剂子称为诱导剂(inducer)，能导致阻遏发生的分子，能

2、导致阻遏发生的分子称为阻遏剂或辅助阻遏剂称为阻遏剂或辅助阻遏剂(corepressor)。在乳糖操纵元中，调控基因在乳糖操纵元中，调控基因1acI位于位于P邻近，有邻近，有其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因群的转录方向一致，编码产生由群的转录方向一致，编码产生由347个氨基酸组个氨基酸组成的调控蛋白成的调控蛋白R，在环境没有乳糖存在的情况下，在环境没有乳糖存在的情况下，R形成分子量为形成分子量为152000的活性四聚体，能特异地的活性四聚体，能特异地与操纵子与操纵子o紧密结合，从而阻止结构基因的转录；紧密结合，从而阻止结构基因的转录；当环境中有

3、足够的乳糖时，乳糖受当环境中有足够的乳糖时，乳糖受-半乳糖苷酶半乳糖苷酶作用转变为别乳糖，别乳糖与作用转变为别乳糖，别乳糖与R结合，使结合，使R的空间的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。在这过程中乳糖在这过程中乳糖(实际起作用的是别乳糖实际起作用的是别乳糖)就是诱就是诱导剂。导剂。5、终止子、终止子终止子终止子(terminator，T)是给予是给予RNA聚合酶聚合酶转录

4、终止信号的转录终止信号的DNA序列。在一个操纵元序列。在一个操纵元中至少在结构基因群最后一个基因的后面有中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。一个终止子。 说明：说明：在没有乳糖存在的情况下，乳糖操纵元并非完在没有乳糖存在的情况下，乳糖操纵元并非完全停止，还存在着本底组成型合成全停止，还存在着本底组成型合成（backgroundconstitutivesynthesis）。因为）。因为阻遏蛋白和操纵子的结合并不是完全牢固的。也阻遏蛋白和操纵子的结合并不是完全牢固的。也就是说，即使没有乳糖存在，也会有少数几个结就是说，即使没有乳糖存在，也会有少数几个结构基因群得以合成，一旦有乳糖或者

5、类似物存在，构基因群得以合成，一旦有乳糖或者类似物存在，马上可以利用。马上可以利用。和阻遏蛋白结合的是别乳糖，而不是乳糖。和阻遏蛋白结合的是别乳糖，而不是乳糖。乳糖+H2O 别乳糖葡萄糖+半乳糖-半乳糖苷酶在研究诱导作用时，并不真正用乳糖进行，因为在研究诱导作用时，并不真正用乳糖进行，因为它会被催化降解。实际上用的是一些化学合成的它会被催化降解。实际上用的是一些化学合成的乳糖类似物，例如异丙基硫代半乳糖苷乳糖类似物，例如异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside,IPTG)。它不受。它不受-半半乳糖苷酶的催化分解，不被细胞代谢而十分稳定，乳糖苷酶的催化分解，不被细胞代

6、谢而十分稳定，但能与但能与R特异性结合，使特异性结合，使R构象变化，诱导构象变化，诱导1ac操操纵元的开放。是很强的诱导剂。还有巯甲基半乳纵元的开放。是很强的诱导剂。还有巯甲基半乳糖苷（糖苷（TMG）。）。事例事例X-gal(5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-半乳糖苷半乳糖苷)也是一也是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被种人工化学合成的半乳糖苷，可被-半乳糖苷半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作酶水解产生兰色化合物，因此可以用作-半乳半乳糖苷酶活性的指示剂。糖苷酶活性的指示剂。IPTG和和X-gal被广泛应被广泛应用在基因工程的工作中。用在基因工程的工作中。 这些替代物都不是真正的酶的底物

7、，所以这些替代物都不是真正的酶的底物，所以称为安慰性诱导物（称为安慰性诱导物（gratuitousinducer）。）。四、真核生物的基因调控四、真核生物的基因调控1、真核生物基因组的特点、真核生物基因组的特点真核基因组比原核基因组大得多真核基因组比原核基因组大得多真核生物主要的遗传物质在核膜内，核外还有真核生物主要的遗传物质在核膜内，核外还有遗传成分，增加了调控的层次和复杂性遗传成分，增加了调控的层次和复杂性原核基本是单倍体，而真核是二倍体原核基本是单倍体，而真核是二倍体原核编码序列绝大多数是连续的，而真核绝大原核编码序列绝大多数是连续的，而真核绝大多数是不连续的多数是不连续的原核基因组中重

8、复序列不多，真核中则存在大原核基因组中重复序列不多，真核中则存在大量重复序列量重复序列真核基因表达调控的环节更多真核基因表达调控的环节更多真核基因转录与染色质的结构变化相关真核基因转录与染色质的结构变化相关真核基因表达以正性调控为主真核基因表达以正性调控为主2、真核生物基因调控的特点、真核生物基因调控的特点第五章第五章DNA重组与基因工程重组与基因工程前言前言基因工程属于生物技术范畴，生物技术基因工程属于生物技术范畴，生物技术（biotechnology）不是一个独立的学科而）不是一个独立的学科而是一套技术或手段。广义的生物技术指任何是一套技术或手段。广义的生物技术指任何利用活的生物体或其一部

9、分生产产品或改良利用活的生物体或其一部分生产产品或改良生物品质的技术；狭义的生物技术是专指以生物品质的技术；狭义的生物技术是专指以DNA重组技术和单克隆技术为标志发展起来重组技术和单克隆技术为标志发展起来的新技术。的新技术。一般认为生物技术包括基因工程、细胞工程、一般认为生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程几方面的内容。基因工程是生酶工程和发酵工程几方面的内容。基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术；细胞技术是物技术的核心和关键，是主导技术；细胞技术是生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件；发生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件；发酵工程是生物技术获得最终产品的手段，四个方酵

10、工程是生物技术获得最终产品的手段，四个方面相互联系的。生物技术是一个综合技术体系，面相互联系的。生物技术是一个综合技术体系，其中基因工程和细胞融合技术最为突出。其中基因工程和细胞融合技术最为突出。蛋白质工程则是在基因工程基础上综合蛋白质蛋白质工程则是在基因工程基础上综合蛋白质化学、蛋白质晶体学、计算机学辅助设计等知识化学、蛋白质晶体学、计算机学辅助设计等知识和技术发展起来的研究新领域，开创了按人类意和技术发展起来的研究新领域，开创了按人类意愿设计和研制人类需要的蛋白质的新时期，被称愿设计和研制人类需要的蛋白质的新时期，被称为第二代基因工程。为第二代基因工程。一般来说，基因工程是指在体外将核酸分

11、子插一般来说，基因工程是指在体外将核酸分子插入质粒、病毒或其它的载体当中，形成遗传物入质粒、病毒或其它的载体当中，形成遗传物质的重新组合，使之进入到寄主细胞内，并且质的重新组合，使之进入到寄主细胞内，并且在寄主细胞当中可以持续稳定地繁殖。基因工在寄主细胞当中可以持续稳定地繁殖。基因工程又叫做基因重组，程又叫做基因重组，DNA重组技术。重组技术。第一节第一节工具酶工具酶 DNA重组技术中对核酸的重组技术中对核酸的“精雕细刻精雕细刻”主主要用酶作为工具。分子生物学研究过程中要用酶作为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多都用作工具。限制性核酸发现的酶，许多都用作工具。限制性核酸内切酶（内切酶（r

12、estrictionendonuclease）在）在重组重组DNA技术中有重要地位，在此做详细技术中有重要地位，在此做详细介绍。介绍。 一、工具酶种类一、工具酶种类1、限制性内切酶：分、限制性内切酶：分I、II、III三种三种2、连接酶：、连接酶：DNA连接酶、连接酶、RNA连接酶连接酶3、聚合酶：、聚合酶：DNA聚合酶、聚合酶、RNA聚合酶聚合酶4、激酶、磷酸酶：碱性磷酸酶、激酶、磷酸酶：碱性磷酸酶、T4多核苷酸激多核苷酸激酶酶5、核酸酶：核酸外切酶、核酸内切酶（、核酸酶：核酸外切酶、核酸内切酶（S1）、）、脱氧核糖核酸酶（脱氧核糖核酸酶（DNaseI）、核糖核酸酶）、核糖核酸酶（RNase

13、A、RNaseH、RNaseT1）6、其他常用酶：甲基化酶、拓扑异构酶、其他常用酶：甲基化酶、拓扑异构酶I、SSB二、限制性核酸内切酶的概念二、限制性核酸内切酶的概念很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解，解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶，能识别特定的核酸序列而将核酸切断内切酶，能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同同时又伴随有特定的核酸修饰酶。最常见的是甲基时又伴随有特定的核酸修饰酶。最常见的是甲基化酶化酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化,从而避免

14、受内切酶水解从而避免受内切酶水解,外来核酸没有这种特异的外来核酸没有这种特异的甲基化修饰甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞这样细胞就构成了限制就构成了限制-修饰体系。其功能就是保护自身修饰体系。其功能就是保护自身的的DNA,分解外来的分解外来的DNA,以保护和维持自身遗传以保护和维持自身遗传信息的稳定信息的稳定,这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。这就是限制性核酸内切酶名称中这就是限制性核酸内切酶名称中“限制限制”二字概二字概念的由来。念的由来。二、限制性核酸内切酶的命名二、限制性核酸内切酶的命名按酶的来源的属、种名而定，取属

15、名的按酶的来源的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株株（Haemophilusinfluenzaed）中先后）中先后分离到分离到3种限制酶，则分别命名为种限制酶，则分别命名为Hind、Hind和和Hind。三、限制性核酸内切酶的分类三、限制性核酸内切酶的分类按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸

16、的情况不同，分为三类：核酸的情况不同，分为三类：类限制性核酸内切酶：由类限制性核酸内切酶：由3种不同亚基构成，种不同亚基构成，具有修饰酶活性和内切酶活性，它能识别和结合具有修饰酶活性和内切酶活性，它能识别和结合于特定位点，随机切断识别位点以外的于特定位点，随机切断识别位点以外的DNA序序列，通常在识别位点周围列，通常在识别位点周围400-700bp（1000-5000bp）。这类酶的作用需要）。这类酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲腺苷甲硫氨酸及硫氨酸及ATP。III类限制性核酸内切酶：与类限制性核酸内切酶：与类酶相似，既有类酶相似，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识内切酶活性，又有修饰

17、酶活性，切断位点在识别序列周围别序列周围25-30bp（24-26bp）范围内，酶）范围内，酶促反应除促反应除Mg2+外，也需要外，也需要ATP供给能量。供给能量。II类限制性核酸内切酶：只由一条肽链构成，类限制性核酸内切酶：只由一条肽链构成，仅需仅需Mg2+，切割，切割DNA特异性最强，且就在识特异性最强，且就在识别位点范围内切断别位点范围内切断DNA。是分子生物学中应用。是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组最广的限制性内切酶。通常在重组DNA技术提技术提到的限制性核酸内切酶主要指到的限制性核酸内切酶主要指类酶而言。类酶而言。 四、限制性核酸内切酶的作用四、限制性核酸内切酶的作用

18、1、切割方式、切割方式大部分限制性核酸内切酶识别大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列序列具有回文结构特征，切断的双链具有回文结构特征，切断的双链DNA都产都产生生5磷酸基和磷酸基和3羟基末端。不同限制性核酸羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同。内切酶识别和切割的特异性不同。 HindIII5AAGCTT33TTCGAA5EcoRI5GAATTC33CTTAAG5切割产生的末端有三种情况：切割产生的末端有三种情况：3粘性末端，粘性末端，PstI，5-CTGCA G-35粘性末端，粘性末端，EcoRI，5-G AATTC-3平末端，平末端，SmaI，5-CCC GGG-32、识别序

19、列频率、识别序列频率1/4N，其中其中N=识别序列的长度识别序列的长度3、同裂酶和同尾酶、同裂酶和同尾酶来源不同但可以识别切割相同的来源不同但可以识别切割相同的DNA序列，序列，产生相同的末端，这样的酶称为同裂酶。如：产生相同的末端，这样的酶称为同裂酶。如：MboI和和Sau3AI（5- GATC -3）来源不同，识别切割的序列也不同，但产生来源不同，识别切割的序列也不同，但产生相同的粘性末端，称为同尾酶。如相同的粘性末端，称为同尾酶。如SalI（5-G TCGAC）和）和XhoI（5-C TCGAG-3）。）。4、影响酶切反应的因素、影响酶切反应的因素1）盐浓度）盐浓度2）pH值值3）甘油比

20、例）甘油比例4）DNA纯度纯度5）DNA甲基化甲基化5、终止子、终止子终止子终止子(terminator，T)是给予是给予RNA聚合酶聚合酶转录终止信号的转录终止信号的DNA序列。在一个操纵元序列。在一个操纵元中至少在结构基因群最后一个基因的后面有中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。一个终止子。 真核基因表达调控的环节更多真核基因表达调控的环节更多真核基因转录与染色质的结构变化相关真核基因转录与染色质的结构变化相关真核基因表达以正性调控为主真核基因表达以正性调控为主2、真核生物基因调控的特点、真核生物基因调控的特点第一节第一节工具酶工具酶 DNA重组技术中对核酸的重组技术中对核酸的“精雕细刻精雕细刻”主主要用酶作为工具。分子生物学研究过程中要用酶作为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多都用作工具。限制性核