免疫方法在藻毒素及贝毒素检测中的应用.

1、郭皓摘要 有害藻类自身或通过食物链在鱼类、贝类等生物体内蓄积，对生物直至 人类产生危害。藻类毒素和贝毒的检测方法要求快速、方便、准确，并且在其 含量极微时即可检出以起到预警作用。免疫方法使之成为可能。本文介绍了免 疫测试技术的基本原理及其在藻毒素和贝毒检测中的应用，总结了该方法的应 用前景和不足之处，旨在常规检测中推广和普及免疫方法。关键词 免疫检测技术 藻毒素 贝毒中图分类号 X834.02The use of immunological methods for the detection of phycotoxin and shellfish toxinGuo HaoNational Ma

2、rine Environmental monitoring Center, Dalian 116023, ChinaHarmful algae can do great harm to organisms even to human through food chain by accumulating in shellfish and fish or by themselves. The immunological examination technique is fast, easy and accurate even in trace amount of phycotoxin and sh

3、ellfish toxin. The theory of immunological diagnosis as well as the prospect and defect of these methods and their application in phycotoxin and shellfish toxin determination are introduced. The method deserves spreading and using in routine monitoring program.Key words: immunological examination, p

4、hycotoxin, shellfish toxin海洋中有毒藻类的爆发性增殖或通过食物链的转化可能对海洋生态环境、 水产养殖业和人类健康安全产生直接或间接的危害。有毒藻类自身或通过在 鱼、虾、贝类等海洋生物体内的蓄积可产生多种毒素，其中危害性较大的几种 毒素分别是麻痹性贝毒(PSP)、腹泻性贝毒(DSP)、神经性贝毒(NSP)、西加鱼毒 素(CTX)、遗忘症贝毒(ASP)等。贝毒危害具有突然性和广泛性，其特点为防治 困难、毒性大、反应快、无适宜解药等。目前世界各国对藻类毒素和贝毒的分 析采用了许多先进技术和方法，如层析，高效液相色谱，质谱及X射线衍射等确定了一些毒素的结构和组成，此外免疫方法

5、也被广泛应用于赤潮毒素检 测。该方法具有快速、准确、便利的特点，利用抗原抗体反应确定毒素类型 及含量。在哺乳动物系统中，当某一特定藻毒素的高敏感毒性达到一个合适的 抗体效价时，免疫反应变得十分复杂。这种免疫测试的敏感性要比相应的鼠生 物测试法或HPLC方法敏感得多一一甚至检测毒素的数量在 pg级(10-12g) 1。1 免疫与免疫测试技术免疫 （immunity） 指机体识别和排除抗原性异物，即机体区分自身与异己的 功能，包括防御、自身稳定和免疫监测三个部分 2。免疫方法包括 ELISA（酶联免疫吸附检测）、RIA（放射免疫分析）、EIA（竞争性酶免疫分析）及 S-PIA法（固态免疫珠检测）等

6、。免疫检测有许多不同类型的分析方法，如直接 和间接配对法 （竞争交叉反应 ）、双抗体“夹心”法检测等。免疫分析检测系统 通常采用放射性标记（RIA）、荧光标记（FIA），免疫电子显微镜法等，也可使用 其他检测模式，如化学发光法 1， 3。用于毒素和贝毒检测的免疫方法为生物体外测试法，以抗原抗体特异性 反应作基础，其中包括凝集反应、沉淀反应、补体参与反应等3。其原理是根据将诸如兔子等暴露毒素中，以功能性抗原刺激兔子产生抗体，然后从兔血 清中提取抗体。抗体可用放射性或荧光物质标记。提取的藻类毒素或匀浆后的 贝类组织 （如贻贝）暴露于标记物，然后检测抗血清抗原混合物中放射性或荧 光强度以测定样品中的

7、毒素含量 4。近十年来，用于藻毒素及贝毒检测的免疫方法得到迅速发展，已有多种可 靠的免疫诊断试剂盒用于分析不同的藻毒素。但由于缺乏与之相关的提纯毒 素，以及难以从相应的小分子毒素如石房蛤毒素 （STX）和软骨藻酸（domoic acid） 中提取稳定的免疫抗原而限制了该研究的发展。IOC（政府间海洋组织）对免疫测 试技术在藻类毒素及贝毒检测中的发展和不足作了较详细的介绍1，本文就免疫测试技术在PSP DSP和NSP检测中的应用进行探讨。用于藻毒素检测的免疫分析由单克隆抗体或多克隆抗体所制备。通常多克 隆抗体比单克隆抗体的生产更加快速而且价廉，对复杂表位具有较高的亲和 力，可以得出异源性广谱分析

8、，即与相应抗原更广泛的交叉反应。单克隆抗体 产生于一个永久性的细胞谱系，尽管比它们的多谱系副本稳定性略低，但能以 较低的变异性连续产生，更加适用于单一表位的检测。免疫测试反应中，具有较少内源性抗原活性 （半抗原）的低分子量组分在接 种前必须与某一载体 （通常为蛋白质 ）相结合。与免疫反应相关的毒素主要来源 于单个容易得到的衍生物，其中可产生毒素的浮游植物和被影响的目标生物通 常有着必然的联系。在免疫方法的发展过程中，交叉反应十分重要。2免疫测试技术在PSP检测中的应用麻痹性贝毒（PSP）是一类烷基氢化嘌呤化合物，类似于具有两个胍基的嘌呤 核，为非结晶、水溶性、高极性、不挥发的小分子物质，在酸性

9、条件下稳定， 碱性条件下发生氧化，毒性消失；毒素遇热稳定，并不被人的消化酶所破坏。 目前已分离出 18种毒素，依基团的相似性分为 3 类：石房蛤毒素 （saxtoxins, STX）、新石房蛤毒素（neoSTX）、膝沟藻毒素（gonyautoxins, GTX1 GTX10及脱 氨甲酰基石房蛤毒素 （carbamyl-N-sulfo compounds, dcSTX） ，其中毒性最强的 为 STX neo STX、GTX1 GTX3和 dcSTX（ 1300Mu屮 mol-1），但其他几种毒素 很容易水解成毒性成份。其来源生物均为甲藻，如 Gonyaulax catenella, Alexan

10、drium tamarense, Peridinium foliaceum, Pyrodinium bahamense var. Compressa 等。麻痹性贝毒是一类神经肌肉麻痹剂，其毒理作用为阻断细胞钠离子通道， 造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用。对人体的中毒量为6005000Mu致死量为300030000Mu目前尚无对症解毒剂。PSP的毒性为LD503.4X10 9。联合国卫生组织规定，100g贝类可食部分的PSPS力超过80卩g（400Mu）时 不得食用58。早期生产的STX多克隆抗血清使用小牛血清白蛋白作为蛋白质载体，其稳 定性和活性较低。一些文献描述 RIA方法(Carlson

11、 et al. ,1985) 和ELISA方 法(Chu and Fan, 1985 ； Davio et al. ,1985)使用不同的交联剂及 STX衍生物产生抗体。上述所有方法都只是使用STX或其化学合成衍生物(如saxitoxi nol) 产生抗体。在评价与其他PSP毒素的交叉反应能力方面，大多数 免疫分析的不足之处关键在于与 neoSTX的交叉反应能力较弱(Carlson et al., 1984; Chu and Fan, 1985)。根据STX多克隆抗体检测PSP毒素所使用的吸附一抑制ELISA技术，是由 STX半抗原与一种多肽聚丙氨酸一赖氨酸(Pal)化学合成载体共价耦联进行制

12、备 的(Cembella et al., 1990)。快速诊断免疫检测试剂盒(SAXITOXIN TESTRInstitut Armand-Frappier) 已是一个成型的商业产品，该分析是将一定数量的 STX固定于聚苯乙烯棒上，在有毒样品一抗体培养混合物中竞争性地联结自由 STX抗体。其后该棒在辣根过氧化物酶(HPR)的结合下培养，在装有酶底物溶液 的透明容器(如小试管)中反应生成有色产物。这种有色物质的吸光度 (0D)可用 分光光度法在450nm处测定。显色程度与STX浓度成反比(即：吸光度为0时， 表示完全为STX吸附；>STXeq >0.64卩g/g贝类组织)。具有较高毒

13、性的样品按 AOAC(1984推隹荐方法在反应缓冲液中进行系列稀释。STX多克隆抗体与SAXITOXIN TEST试剂盒的反应结果显示出相对广泛的 抗原特性，并最少与两种膝沟藻毒素(GTX2、GTX3的交叉反应良好，但与低含 量的dcSTX没有交叉反应(Cembella et al., 1990)。与不同纯化程度的氨基甲酸酯毒素(carbamate)5分钟接合的亲和性(相对STX)表示如下：GTX3(87%) GTX2(74%，) NEO(60%。) 这种交叉反应模式提示首先通过胍基与中心核相连发生 结合反应，胍环N-1, 2, 3与N-7, 8, 9作为抗体结合反应的识别位，dcSTX 的N

14、-21位置的SO2-3组分阻断与抗体的联系，这种与 dcSTX缺乏交叉反应的情 况对总毒素含量(卩g, STXeq)的测定不是关键问题，这是因为这些衍生物实际 上很少比氨基甲酸酯毒素有效，并且它们可以在分析之前水解成氨基甲酸酯类 似物。其它生物毒素包括软骨藻酸、大田软海绵酸 (okadaic acid) 及 staphylococcus内毒素B等在这种免疫分析中不具备交叉反应。与使用HPLC-FD法和AOAC常规鼠生物测定法对有毒贝类毒性测试结果相 比，SAXITOXIN TE STR式剂盒在毒素含量低于 STXeq/ g/g贝类组织时所得出 的可比结果没有假阳性反应。这种多克隆抗体对实验室内

15、培养的浮游植物中 PSP检测十分有用，包括从温带和亚热带海区分离出来的涡鞭毛藻，其中 Alexandrium sp 为浮游植物自然种群组成中的优势种 (Cembella and Lamoureux, 1993) 。在类型测试实验中，由多克隆抗一STX抗体制备的直接EIA，通过将STX与 辣根过氧化物酶结合，以较高的灵敏性检测贝类组织中STX(34ng*g-1 组织)(Usleber et al., 1991)。更进一步的研究显示，对异质 PSP毒素酶(heterologous PSP toxin-enzyme) 复合体与提纯毒素的交叉反应结果比较，直 接 EIA 方法通常比不直接的方法更为敏感

16、。在抑制酶联免疫过滤测试 (ELIFA) 实 验中，通过结合使用滤膜改变一下实验方法，就可以对毒素含量进行一个简单 而又快速的测定。尽管交叉反应对 neo STX不敏感，但可以检测到贝类组织中 相当于或低于0.80卩g.g 1组织水平时的STX GTX2 GTX3 de STX。目前已经生产出用于检测贝类组织中STX的商用试剂盒(RIDASCREENR R-Biopharm) 。这种免疫测试隶属于联合实验，并与欧洲测试委员会及测试计划 (BCR)的其他测定方法相对应(Van Egmond et al., 1994)。毫无疑问，对于未确定的交叉反应来说，在贝类组织细胞间质中存在其它PSP毒素时，

17、ELISA方法过高估计了结合于其中的STX这种方法对分析贝类提取物中 STX或许是十 分有用的，但仅被用于半定量分析。3免疫测试技术在DSP检测中的应用腹泻性贝毒(DSP)为具有多个环状醚的脂肪酸衍生物，不溶于水，能溶于甲 醇、乙醇、丙酮、氯仿和乙醚等有机溶剂，属脂溶性物质，紫外线不吸收，对 一般加热较为稳定。目前已发现的腹泻性贝毒至少有 12种，其中 9种结构已经 确定，分为 3 类：大田软海绵酸 (okadaie aeid, OA) 及其衍生物鳍藻毒素 - 1(dinophytoxins, DTX-1) 、鳍藻毒素 -3(DTX-3) ；大环内酯贝毒素 -1(PTX- 1) 、扇贝毒素 -

18、2(PTX-2) 、扇贝毒素 -3(PTX-3) 、扇贝毒素 -6(PTX-6) ；磺化毒 物，虾夷扇贝毒素 (Yessotoxin, YTX) 及其衍生物 45OH YTX。腹泻性贝毒主要作用于酶系统，为肿瘤促进剂。可引起人类多种不适反应，对人的最小中毒量为 1218Mu(1Mi相当于3.2卩gDTX-1)，DSP的毒性为 LD50192X 10-9。日本厚生省规定，贝类可食部分的毒力不得超过0.05Mu*g-1 。其来源生物多为甲藻，如 Dinophysis fortii, D. aeuminota, Proroeentrum lima 等8,9。一些免疫诊断方法用于 DSP毒性测定，女口

19、 RIA(Levine et al., 1988) 及 ELISA(Chin et al., 1995) 。所有混合抗体的制备都与单一腹泻源大田软海绵 酸(OA)有关。用于OA测定的RIA3H标记竞争结合过程具有高度敏感性(检 出限： 0.2pmol OA) 。相对水生生物毒素的变化，包括 maitotoxin 、 aplysiatoxin 、palytoxin 、brevetoxin B 及 lyngbyatoxin A 等，该反应显示 非竞争抑制。但作为常规检测而言，该方法过于复杂和繁琐。用于OA定量分析的典型方法为ELISA法，该方法显示测定DSPS性特别是 DTX-1 的交叉反应情况。

20、尽管对其他衍生物的亲和性明显不同， DSP-eheek ELISA试剂盒(UBE In dustries, Tokyo, Japa n)已经被广泛用于检测 DSP毒素(OA及DTX-1)。但在要求的检测限20ng*g-1，许多研究报告显示无论浮游植物 或贝类样品都出现过包括假阳性反应的不一致性结果。DSP-eheek的单克隆抗体与DTX-1的交叉反应相当于 OA水平，但PTX和 YTX不发生反应(Usagawa et al., 1989) 。Riugier Bio-Reeh ELISA试剂盒使用抗 OA单克隆抗体及抗个体基因型抗体(anti-idiotypie antibody)在抗OA抗体的

21、结合位上与 OA相对应(Shestowsky et al., 1993)。DTX-1 或 DTX-2,以及 OA的甲基、甲二醇和乙醇衍生物都可以与这种试剂盒中抗体相结合，但该抗体显示出对OA有较高灵敏性，而与DTX-3和短裸甲藻毒素-1(brevetoxin-1)根本不具备交叉反应。后一种测试试剂盒经过与DSP毒素其他测试方法(如HPLC和LC-MS的广泛比较，被认为对贻贝组织提取液或是对浮游植物样品中 0A 含量的检测同样具有较高可信 度 (Chin et al., 1995)。4免疫测试技术在NSP检测中的应用神经性贝毒(NSP)主要因贝类摄食短裸甲藻(Gymnodinium breve,

22、 1979 年 改称 Ptychodiscus brevis) 后在体内蓄积，被人食用后产生以麻痹为主要特征 的食物中毒。从有毒藻类细胞中分离出 9种神经性毒素成份，并已确定其中 7 种成份的化学结构，分别命名为短裸甲藻毒素B(BTXB)短裸甲藻毒素C(BTXC) GB3-6 PB-1。短裸甲藻毒素(Brevetoxin, BTX 或 PbTx)由 11 个反式 相连的醚环形成的长链组成梯形结构，不含氮，为低熔点耐热固体，具高度脂 溶性，难溶于中性和酸性水溶液中，能溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、 苯、二硫化碳等有机溶剂和1%NaO溶液中8。短裸甲藻毒素可以引起鱼类的大量死亡，当在赤潮区周围

23、吸入含有有毒藻 类的气雾时，也会引起气喘、咳嗽和呼吸困难等中毒症状。其作用机理是在相 当负电位时选择性地开放钠通道，并且抑制快速钠离子的失活而使细胞膜去极 化。BTXB对小鼠的半致死量为5X10-7 , BTXC对小鼠的半致死量为2.5 X 10- 7。目前应用RIA方法检测与NSP相关的裸甲藻毒素(Baden et al., 1984；Levine and Shimizu, 1992)。现已制备出可靠的用于测试 NSP组分的ELISA单 克隆抗体 (Trainer and Baden, 1991) 。把这种单克隆分子与短裸甲藻毒素 (PbTx)相联，由于它们表现出与CTX的一些交叉反应，可被

24、用于非定量地检测 毒素的归属。检测PbTx的RIA技术(Baden et al., 1995)是根据从复杂组分竞争替换3H-PbTx-3的抗体。在ELISA方法中，同样的抗-短裸甲藻毒素抗体 在第一抗体与毒素结合后与兔抗羊IgG-辣根过氧化物酶(rabbit anti-goat IgG-horseradish-peroxidase) 联接。Baden在最初实验时用牛血清蛋白(BSA)与PbTx-3相联形成抗原，并且发 现这种血清与PbTx-2和PbTx-3出现竞争结合(Baden et al., 1984)，抗体也与无毒性的PbTx衍生物相联并具有同样的联结亲和性，因此测试结构比功能更 加重要。当用KLH(钥孔碱血蓝素)作为BSA的替代品时，相对每fmol KLH约 75100fmol蛋白质比率的较高毒性可以产生出更为有效的抗体。研究认为根据两种不同抗一PbTx血清，无论使用自然产生或人工合成的短 裸甲藻毒素衍生物对抗原表位识别的方法均显示单一抗体分析不适用于检测毒 素的代谢情况 (Poly et al., 1995) 。目前已发展到使用多个特殊设计的抗体以 确定不同范围聚醚阶层 (polyether ladder)(Melinek et al., 1994)。免疫方法除