苹果黑腐皮壳菌Valsamali的两类效应蛋白VmHEPs及VmPODs的功能及机制研究

1、苹果黑腐皮壳菌Valsa mali的两类效应蛋白 VmHEP及VmPODs的功能及机制研究苹果黑腐皮壳菌Valsa mali 是导致苹果树腐烂病的主要植物病原真菌 , 极大威胁我国的苹果产业。植物病原真菌在侵染寄主的过程中需要多种重要的致病因子参与, 效应蛋白则是其中非常关键的一类。目前所发现的植物病原真菌的效应蛋白大多都不具有保守功能域, 但这些具有保守功能域的效应蛋白已在植物病原卵菌和细菌中被证实具有极其重要的意义, 因此对植物病原真菌中具有保守功能域的效应蛋白的研究有利于深入揭示植物病原真菌的致病机制。Hce2功能域是目前被发现的分布最为广泛的一类植物病原真菌效应蛋白保守功能域 , 但其

2、致病的作用方式及机制尚不明确;Pod( Peroxidase )功能域在生物生理代谢方面的功能已经被深入研究, 但研究多集中于一些含有该功能域的非分泌胞内酶上, 该功能域是否能以效应蛋白的形式参与植物病原真菌致病的过程尚不清楚。目前,V.mali 中尚未发现具有保守功能域的效应蛋白。本研究基于一系列生物信息学技术和分子生物学技术对V.mali中含有Hce2功能域的五个效应蛋白 VmHEPs(VmHEP 1 VmHEP2VmHEP3VmHEP4 VmHEB5进行了挖掘和功能研究,并对其中具有激发植物细胞坏死功能的 VmHEP!行了上游调控及下游靶标的进一步筛选和研究; 与此同时 , 本研究还发现

3、了一类含有Pod( Peroxiadase )功能域的效应蛋白普遍存在于各种不同植物病原真菌中, 并通过功能研究证明V.mali 中的三个该类型效应蛋白 VmPODSVmPOD1VmPOD2 VmPOD3对 V.mali 的生存和致病有诱导的基因启动功能并且效应蛋白 VmHEP能够与苹果蛋白MdLRRPI都重要贡献。主要研究结果如下：(1)含Hce2功能域的效应蛋白VmHEPS串联基因冗余互补的方式参与 V.mali致病过程本研究首先从88个候选效应蛋白中鉴定得到一个具有 Hce2保守功能域且能引起 植物细胞坏死的效应蛋白VmHEPIt一步从分泌蛋白组中鉴定出四个与VmHEP冏源且具有分泌功能

4、的同源蛋白 (VmHEP2VmHEP3VmHEP4和VmHEP)5;经过基因瞬时表达确认，在VmHEP中仅有VmHEP能够引起细胞坏死；进化分析显示五个VmHEP基因是旁系同源基因(paralogs )，其中的 VmHEP和 VmHEP2于 symparalogs( in-paralogs ) , 而其他三个基因属于alloparalogs( out-paralogs ) ,此外 , 在进化过程中五个基因两两之间并未发生显著的非同义氨基酸替换，处于纯化选择状态。致病力检测发现，分别敲除VmHEP单个基 因后,V.mali的致病力并未发生改变，但VmHEP申VmHEP能口 VmHEP2 基因在侵

5、染早期均明显的上调，将VmHEP和VmHEP固时敲除后,V.mali致病力发生显著下降。后续分析发现，VmHEP评口 VmHEP2处于 11 号染色体且两者间物理位置仅仅相距604 bp, 与此同时qRT-PC虚示在V.mali侵染苹果枝条时，VmHEP能勺缺失会显著促进VmHEP2调，反之VmHEP2缺失也会促进VmHEP的显著上调。本研 究证明V.mali的五个VmHEP基因是不同种类的旁系同源基因，处于 纯化选择状态，其中的VmHEP能够激发细胞坏死，同时VmHEP能VmHEP2 V.mali的重要毒性因子，以基因冗余互补的方式参与致病， 同时说明植物病原真菌的效应蛋白可以通过基因串联拷

6、贝的冗余协作模式参与致病。(2) VmHEP能因的上游非编码区具有受侵染事件互作本研究进一步对 VmHEP中唯一可以引起细胞坏死的效应蛋白 VmHEPl行了上游启动区域功能和下游互作靶标的鉴定和研究。基 因组信息分析发现VmHEP能因的上游1500 bp为非编码区域；基于 V.mali 的遗传转化体系, 本研究证实该能500 bp 非编码区域内存在启动区域能够在V.mali中启动转入的外源GFF®因，并且通过qRT-PCR 证实该启动区域的启动功能受到侵染事件的诱导。此外, 通过酵母双杂筛选、免疫共沉淀技术和质谱技术验证，发现效应蛋白VmHEP能够 与一个来自苹果的具有富亮氨酸重复结

7、构域（LRR的蛋白激酶 MdLRRP结合；进一步利用VIGS技术将MdLRRP基因在本氏烟中的同 源基因NbSERK3行基因沉默，并在基因沉默植株中进行 VmHEP的瞬 时表达,最终通过电解质渗透率检测发现效应蛋白 VmHEP所引起的 本氏烟叶片细胞坏死程度在NbSERK基因被沉默的基因沉默植株中 显著降低。本研究证实了 VmHEP能因上游存在一个受侵染事件诱导 的启动区域，并且初步鉴定了效应蛋白 VmHEP能够与苹果中的靶标 蛋白MdLRRPI吉合和互作。（3）含Pod功能域的效应蛋白 VmPODS V.mali的产抱、H<sub>2v/sub>O<sub>2v

8、/sub>寸受能力和致病力有 显著影响且普遍存在于其它真菌中为了探究苹果黑腐皮壳菌中是否存在尚未被关注的具有保守功能域的效应蛋白, 本研究根据效应蛋白特征对基因组和分泌蛋白组进行了进一步分析, 分析发现了三个具有信号肽且拥有Po（d Peroxidase ） 保守功能域的候选效应蛋白VmPOD、 能VmPOD2及VmPOD3序列分析显示，VmPOD具有两个过氧化氢酶功能域;VmPOD具有一个氯化物过氧化物酶功能域；VmPOD具有一个植物类过氧化物酶功能域。酵母系统的分泌试验证明三个候选效应蛋白均具有分泌功能。分别对3个基因进行敲除后发现 VmPOfD 1A VmPOD2及4 VmPOD3

9、营养生长未受影响，但其分生抱子的产生能 力相比于野生型03-8显著下降；与此同时,VmPOD1zVmPOD2z VmPOD3添力口有 0.06 mol/L H₂O₂勺 PDA± 受到比野生型03-8 更为严重的抑制, 说明三个候选效应蛋白参与应对外部环境中H₂O<sub>2</sub舟）胁迫压力；进一步 qRT-PCF®示三个VmPODS因均在V.mali侵染苹果的初期显著上调， 可能参与了 V.mali侵染早期与苹果的

10、互作；并且VmPODS本氏烟叶 片中瞬时表达后能够显著抑制坏死激发子INF1 引起的烟草叶片电解质渗漏，显示VmPODs定程度上抑制了 INF1激发的细胞坏死，干扰了 INF1激发的植物抗病反应。除此之外，基因敲除突变体 VmPOD3致 病力显著下降，证实了 VmPOD的确直接参与了 V.mali的致病过程并 对其致病力有显著贡献。进一步序列分析显示，VmPOD研源蛋白广泛 存在于不同真菌中，其中VmPOD#在于27个真菌属中，VmPOD存在 于30个真菌属种，VmPOD存在于48个真菌属中，其中包括多种重要 植物病原真菌。本研究证明VmPODS一类对V.mali生存和侵染过程 有显著贡献的效

11、应蛋白，Pod功能域可以以效应蛋白的方式参与致病， 含Pod功能域的候选效应蛋白普遍存在于真菌界中，是一类具有潜在 的重要功能的效应蛋白。能域;VmPOD具有一个氯化物过氧化物酶功能域；VmPOD具有一个植 物类过氧化物酶功能域。酵母系统的分泌试验证明三个候选效应蛋白 均具有分泌功能。分别对3个基因进行敲除后发现 VmPODIA VmPOD以及 VmPOM）营养生长未受影响，但其分生抱子的产生能 力相比于野生型03-8显著下降；与此同时,AVmPODI AVmPOE® A VmPO陈添力口有 0.06 mol/L H₂O<sub&g

12、t;2</sub PDA± 受到比野生型03-8更为严重的抑制，说明三个候选效应蛋白参与应 对外部环境中Hvsub>2v/sub>O<sub>2v/sub泊勺胁迫压力；进一步 qRT-PCF®示三个VmPO匿因均在V.mali侵染苹果的初期显著上调， 可能参与了 V.mali侵染早期与苹果的互作；并且VmPODfc本氏烟叶 片中瞬时表达后能够显著抑制坏死激发子 INF1引起的烟草叶片电解 质渗漏，显示VmPODI定程度上抑制了 INF1激发的细胞坏死，干扰了 INF1激发的植物抗病反应。除此之外，基因敲除突变体 VmPO而致 病力显著下降，证实了 VmPOD的确直接参与了 V.mali的致病过程并 对其致病力有显著贡献。进一步序列分析显示，