细胞实验指导

1、细胞生物学实验指导材料（详见实验参考书）生物绘图法 -绘、标、注 (1) 合理布局画图以前，先估计一下要画的图占多大面积，不可太大，也不要过小。图在纸上的位置，要安排得当，不应过于偏向一边。 (2) 先绘草图画图的时候，先把铅笔(一般用2H或3H的绘图和文字一律用3H铅笔)削尖，在纸上轻轻画出轮廓，经过修改，再用铅笔画出清晰的细胞结构图。要注意细胞各部分的大小比例、部位关系，务必使图形正确。 (3)细胞中较暗处，用铅笔点上细点来表示，不可用铅笔涂抹。明暗和颜色深浅用不同密度圆点表示 (4)画好的图，要注明细胞结构各部分的名称。图注在右侧,平行线引出(5)练习左眼看显微镜，同时右眼看着练习画图。

2、实验1、普通光学显微镜使用和细胞观察目的：认识植物细胞和动物细胞的基本结构；初步掌握制作临时装片和画生物图的方法；练习使用显微镜。用品：材料用具 洋葱头，红墨水或稀释的碘液，清水，显微镜，镊子，解剖针，刀片，载玻片，吸管，吸水纸，纱布，生理盐水，牙签，浓度为0.0010.005g/mL的高锰酸钾水溶液方法步骤：一、植物细胞观察1、洋葱鳞片叶表皮细胞 先把载玻片和盖玻片用纱布擦干净：用吸管在载玻片中央滴上一滴清水，用镊子从洋葱鳞片叶上撕下一小块表皮，放入载玻片的水滴中，用解剖针展平，再用镊子夹起盖玻片，轻轻地盖在洋葱表皮上。盖的时候，让盖玻片的一边先接触载玻片，轻轻地放平，以免水中产生气泡。 把

3、洋葱鳞片叶表皮装片放在低倍镜下观察。洋葱鳞片叶表皮细胞排列得很整齐，每个细胞都有很明显的细胞壁、细胞质、细胞核和液泡(细胞膜紧贴着细胞壁，不易辨认)。这几部分都是无色的，是洋葱鳞片叶表皮细胞的本来面貌。为了观察得更清楚，可用吸管稍稍吸一点红墨水或稀释的碘液，滴在盖玻片的一边，从相对的一边用吸水纸吸水，使红墨水或碘液很快地弥漫到整个盖玻片的下面。这样，洋葱鳞片叶表皮细胞内各部分结构染上了深浅不同的颜色。2、马铃薯块茎涂片观察   在载玻片上滴一小滴水； 刮取少量马铃薯块茎粉浆于水中；盖上盖玻片，吸去多余水分； 显微镜下观察。3、桔皮制片  溶生性分泌腔：内

4、分泌结构4、红辣椒果肉细胞临时制片： 取一小方块红辣椒果皮，尽量多地割去果肉； 然后放在载玻片上，果肉面朝上，用刀片尽量多地刮去果肉； 取最薄部分果皮，用水装片，吸去多余水分后；显微观察细胞和有色体，细胞壁、纹孔。5、藓叶片临时装片在干净载玻片上滴一滴水；取一片藓叶片于水中；盖上盖玻片，吸去多余水分后；显微镜下观察： 叶绿体二、动物及人体细胞 1.观察人的口腔上皮细胞 1制作临时装片 拿一块载玻片，在中央滴一滴生理盐水。用凉开水把口漱净。取一根牙签，放在质量浓度为0.0010.005g/mL的高猛酸钾溶液里消毒以后，伸进口腔，在口腔壁上轻轻地刮几下，牙签上就附着了一些碎屑。把牙签放到载玻片的水

5、滴中涂一下，盖上盖玻片，制成装片，放在显微镜下观察。 三、体视显微镜的使用简单选择几种材料：植物花或果实，芽在显微镜下直接观察和操作人体染色体装片观察总结 通过自己的观察，总结人体细胞与植物细胞的结构有哪些异同。注意事项：1. 显微镜的使用要避免粗暴使用，调节钮要慢慢旋动2. 爱护镜头，尤其物镜，小心损坏。实验2.自制暗视野显微镜及活体观察目的 掌握暗视野显微镜的成像原理，掌握用暗视野显微镜进行活体观察。熟练掌握光路合轴，学会将普通透射显微镜改造成暗视野显微镜。自制遮光板。用品：普通显微镜，剪刀，不透光纸实验内容1. 原理 暗视野显微镜是根据丁达尔效应的原理设计的。它比普通显微镜的分辨率高50

6、倍，虽然对被检物体的细微结构分辨不清，但却可以看到0.004cm以上的微粒子的存在。由于直射光光束被挡光板挡住不能进入物镜，因此视野变暗。而折射光线集中到被检物体上时散射发出亮光，通过物镜达到观察者眼中，即取得暗视野效果。但是用中心挡光法除了选择适当直径的中心挡光片外，还须考虑反射镜的角度，光源的强度等因素，才能取得好的效果。2.中心挡光法的操作 每片挡光板只能与一个特定的物镜相匹配，现以10倍物镜相匹配的挡光板制作方法为例。 2.1 准备一块无色滤光片，为10倍物镜制作挡光板。首先进行调焦使物像清晰。取下显微镜的目镜观察，调节聚光器的可变光阑与10倍物镜正好匹配。然后取下聚光器，用圆规小心地

7、量出可变光阑此时所开的孔径。 2.2 用剪刀作一个和光阑大小一样的圆形黑纸片，并贴在滤光片中央。在浆糊未干时立即放到托架上（黑纸片朝下），在没有目镜的情况下向镜筒中看，仔细调整黑纸片的位置，使它正好能挡掉整个视场的光而成为全暗的。四周不漏光。待浆糊干后即成为一块用于10倍物镜的中央挡光板。 2.3 用同样的做其他物镜相匹配的挡光板。 2.4 操作时应注意：1）聚光器的焦点对准被检物。2）黑纸片的大小和位置要适宜，对观察效果的影响很大。对于10倍物镜的黑纸片，直径允许稍大于可变光阑与物镜相匹配时所开启的口径；而40倍物镜则应力求黑纸片直径与光阑所开的口径相同大小。3）镜口率在0.85以下。4）若

8、在聚光器上端透镜与载片之间放香柏油或液体石蜡后观察效果更好。5）照明光线要强。 3暗视野的观察4按普通显微镜的用法获清晰的像后，安装上与物镜相匹配的中心挡光板。调可变光阑到最大极限，以获得最大的照明。用同样的方法进行高倍镜观察。 中央遮光板实验报告：1.写出自制暗视野显微镜的方法及步骤及使用暗视野显微镜的注意事项，2. 绘制暗视野下观察到的原生动物图形。实验3. 细胞计数目的 学习、掌握细胞培养中最基本的细胞计数方法。原理 应用显微镜的成像原理，并借助血细胞计数板，计算单位体积的细胞或微小生物的数量。用品材料：酵母细胞药品：0.17mol/L氯化钠溶液 仪器：普通光学显微镜、细胞计数板、吸管及

9、胶头。步骤酵母观察：1稀释：将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。2镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。3加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），使菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。静置510分钟即可计数。4显微镜计数:将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有510个菌体为宜。若选用25

10、×16规格的计数板则每个计数室选5个中方格，可选4个角和中央的中格（即80个小格），若选用16×25规格的计数板，则数四个角：左上、右上、左下、右下的四个中方格，（即100小格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。5清洗血球计数板：使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其化沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。6、实验报告1将结果记录于下表中。

11、A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。 各中格中菌数AB菌数/ml二室平均值12345第一室第二室2为什么用两种不同规格的计数板测同一样品时，其结果一样？注意事项1、务必使细胞分散成单个细胞，取样计数前，应充分混匀细胞悬液。2、充液后静止1-2分钟，待细胞下沉后，方可进行计数。3、对于分布在刻线上的细胞，依照“数上不数下，数左不数右“的原则进行计数。计数时，如发现各中方格的细胞数目相差20个以上，表示血细胞分布不均匀，必须重新计数。4：细胞膜的渗透性目的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。原理 当红细胞置于不同等渗溶液中时，由于对各种溶质的通透性不同，因此有的溶质分子可透入

12、，有的溶质分子则不能透入，能透入的溶质分子的速度也不同。当溶质分子进入红细胞使细胞内溶质浓度增加时，导致水的摄人。红细胞膨胀 到一定程度时，细胞膜破裂，血红素溢出即红细胞发生溶血。由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同。用品材料：兔。试剂：0.17 mol/L氯化钠，0.17 mol/L 氯化铵，0.17 mol/L硝酸钠，0.12 mol/L硫酸 钠，0.10 mol/L草酸钠，0.10mol/L醋酸钠， 0.32 mol/L葡萄糖，0.32 mol/L甘油，0.32 mol/L乙醇，0.32mol/L丙酮。 仪器：显微镜，注射器，手术器械，载 玻片，盖玻片，吸管，小烧杯，试管，秒表。步骤1.

13、 兔子用注射器耳静脉取血，取小烧杯2只，分别加1份经肝素抗凝的兔血(或小鼠血)和10份0.17molL氯化钠， 成为一种不透明的红色液体，此即稀释的兔血(或小鼠血)。2. 取试管1支，加入10mL蒸馏水，然后再加入1 mL稀释的兔血(或小鼠血)，注意观察溶液的颜色变化，溶液由不透明的红色变为红色透明，红细胞发生破裂，造成所有红细胞溶血，使光线容易通过。显微镜下观察溶血前后红细胞的形态。 3. 观察红细胞对各类物质的渗透性:取试管10支，分别加入上述10种溶液各5 mL，再 加入0.5mL稀释的兔血(或小鼠血)，记下时间，轻轻摇动使混匀，注意是否发生溶血；若发生溶血，记录溶血过程所需的时间。结果

14、实验报告将实验结果填人表中，并分析结果: 试管编号所加试剂和浓度是否溶血时 间结果分析123456思考题1.推断下列溶液的溶血反应会如何：0.17 mol/L氯化钾、0.17 molL硝酸钾 0.12molL氯化镁、0.12 molL氯化钙、0.10 molL硫酸钾、0.10molL醋酸钾、0.10mol/L 柠檬酸钠、0.32 molL，甘露醇、0.32mol/L 蔗糖。 实验5：细胞的凝集反应实验目的学习研究细胞凝集反应的方法，了解细胞发生凝集反应的原因原理 凝集素是一类含糖、并能与糖专一结合的蛋白质，被认为与糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂的调控有关。凝集素使细胞凝集是

15、因为它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞发生凝集。 大多数凝集素存在于储藏器官中，作为一种氮源；对某些植物而言，受到危害时，凝集素作为一种防御蛋白发挥作用。凝集素与糖结合的活性及专一性决定其功能。用品材料：马铃薯块茎，韭菜叶片试剂：(1)磷酸缓冲液：分别称取氯化钠7.2g和磷酸氢二钠1.48g用蒸馏水溶解，混合后用蒸馏水定容至1000ml，调pH值至7.2。(2) 2%兔血细胞：以无菌方法抽取兔的静脉血液（加肝素抗凝剂）用生理盐水洗5次，每次2000r/min离心5min，最后按红细胞体积加生理盐水配成2%兔血细胞液。(3)生理盐水。仪器：研钵，

16、离心机，载玻片，光学显微镜。步骤1.马铃薯块茎：(1)提取凝集素：称取马铃薯去皮块茎4g，加少许磷酸缓冲液研磨成匀浆，最终加到30ml磷酸缓冲液，浸泡2h，浸出的粗提液中含有可溶性马铃薯凝集素。(2) 测定血凝活性：用滴管吸取马铃薯凝集素粗提液和2%兔血细胞液各一滴，置载玻片上，充分混匀，静置10 min后于低倍显微镜下观察细胞凝集现象。2.韭菜叶片：(1)取韭菜叶片35g用蒸馏水洗净剪碎，按1：1（W/V）加入生理盐水，用捣碎机或研磨成匀浆，过滤，滤液在5000r/min下离心20 min，弃沉淀,留上清液。(2)上清液加硫酸胺（约1.8 g）至60%饱和度沉淀（不同饱和度硫酸胺沉淀蛋白质表

17、）, 5000r/min下离心20 min，沉淀用1ml磷酸缓冲液溶解。(3)用滴管吸取韭菜凝集素提取液和2%兔血细胞液各一滴, 置载玻片上，充分混匀，静置10 min后于光学显微镜下观察细胞凝集现象。用一滴磷酸缓冲液和一滴2%兔血细胞液混合作为对照观察。实验报告1.绘图表示血细胞凝集现象，并说明原因。2.比较马铃薯和韭菜凝集素的凝集效果。（可用凝集率、细胞产生凝集所需时间作为比较依据）思考题1.植物细胞凝集素在兔红细胞液凝集过程中起的作用？2.哪些因素影响细胞凝集反应？实验6：叶绿体的分离与荧光观察实验目的了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。原理

18、60;   叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000r/min离心，可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。在室温下进行分离要迅速。    某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（

19、如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。用品材料： 菠菜叶片试剂：蒸馏水，0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙。仪器：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，接种针，目镜测微尺，物镜测微尺，恒温箱，培养皿，滤纸，试管，试管架，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管。步骤一、叶绿体的分

20、离与观察1.选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于0.35mol/L氯化钠溶液15ml中置 组织捣碎机或研钵中。2.利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆，35min，或研磨成匀浆。3.用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。4.取滤液4ML在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。5. 将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。6.沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。7.取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察时，叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上

21、无荧光的盖玻片后即可观察。8.观察叶绿体的形态结构、测量15个叶绿体的长轴和短轴、叶绿体发射荧光的现象。结果 二、菠菜叶手切片观察 用剔须刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削出一斜面置于载玻片上，滴加12滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。 (1)在普通光镜下观察。 (2)在荧光显微镜下观察其直接荧光。(3) 观察间接荧光：向手切片上滴加12滴0.01%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液, 加盖片后可在荧光显微镜下观察间接荧光。 实 验一般可能的现象： 一、叶绿体的分离和观察 1. 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。

22、 2. 以Olympus荧光显微镜为例，在先用B(bule)激发滤片、B双色镜和O530(orange)阴断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。 3. 加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。 二、菠菜叶手切片观察 1. 在普通光镜下可以看到三种细胞 (1)表皮细胞: 为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞; (2)保卫细胞: 为构成气孔的成对存在的肾形细胞；(3)叶肉细胞: 为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。 2. 在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱, 气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色

23、叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。 3. 用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光, 气孔仍为绿色。实验报告1.观察叶绿体的形态结构,测量510个叶绿体的长轴和短轴求其平均值。2.记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发荧光和次生荧光现象，分析结果。注意事项（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯515min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。（3）防止紫外线对眼睛的损害。（4）检查时间每次以12h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐

24、下降，荧光减弱；标本受紫外线照射35min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过23h。（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。（7）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”无或可见微弱荧光。“+”仅能见明确可见的荧光。“+”可见有明亮的荧光。“+”可见耀眼的荧光。思考题1.分离叶绿体实验的原理是什么？操作过程中应注意什么？2.普通光学显微镜和荧光显微镜的原理有何异同点？

25、7、线粒体和液泡系的超活染色与观察活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。 通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴

26、离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus green B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。 实 验 目 的1、观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布； 2、学习一些细胞器的超活染色技术。实 验 原 理 线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B是线垃体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些