62-EB病毒(EBV)核酸检测规范标准操作技巧规章(荧光PCR法)

1、EB病毒（EBV ）核酸检测标准操作规程（荧光PCR法）1. 目的规范EB病毒核酸DNA （荧光PCR法）检测操作流程，准确进行EB病毒DNA分析。2. 应用范围使用中山大学达安基因股份有限公司 EB病毒核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒（荧光PCR法）和MX3000P荧光定量PCR仪、Roche480荧光定量PCR仪进行EB病毒DNA检测。3. 职责由PCR实验室制定程序文件，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实施。4. 内容4.1实验原理及其临床应用本试剂盒用一对EB病毒（EBV）特异性引物和一条EB病毒（EBV）特异性荧光探针，配 以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核

2、苷酸单体（dNTPs ）等成分，用PCR体外扩增 法检测EB病毒（EBV） DNA。用于人血中EB病毒DNA的测定，为临床提供参考，4.2标本采集4.2.1使用标本类型：全血。4.2.2标本采集；由合作单位按照以下要求进行采集。4.2.2.1全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血 2毫升，注入EDTA（乙二胺四乙酸二钠） 或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合 5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混 匀，密闭送检。4.2.3标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于 -20 C待测，保存期为6个月。 标本运送采用0 °C冰壶。4.3试剂准备431供应商：中山大学达安基因

3、股份有限公司432此实验试剂应放在冰箱-20 C保存，在实验前5分钟取出备用，实验后应立即放回冰箱-20 C。433如果试剂出现了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂，应及时更换。4.4质控品4.4.1质控品来源：随试剂盒，由厂家提供。4.4.2质控品保存条件：置于-20 C冰箱中保存。4.4.3质控频度：每次实验均需做质控。4.5操作过程说明4.5.1 DNA 提取4.5.1.1质控品处理：取出阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品。8000rpm离心数秒，吸50ul至0.5ml灭菌离心管中，加入50U1DNA提取液充分混匀，100 C恒 温处理10 ±1分钟；12000 rpm

4、离心5分钟，备用。4.5.1.2样本处理4.5.1.2.1取全血500ul至干燥玻璃试管中，加入生理盐水 500ul轻摇混匀；4.5.1.2.2取干燥玻璃试管加入1ml淋巴细胞分离液；4.5.1.2.3将稀释好的全血用移液器缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中（注意沿着管壁, 速度要慢）;4.5.1.2.4 2000rpm 离心20分钟（建议用水平离心机）；4.5.1.2.5吸取白细胞层（从上往下第二层），加入1.5ml离心管，12000rpm离心5分钟；4.5.1.2.6去上清，沉淀中加入50ulDNA提取液充分混匀，100 C恒温处理10 ±1分钟；12000rpm 离心5分钟，上

5、清备用4.521加样：取PCR反应管若干，加入处理后的样品（标本、阴性质控品、临界或强阳性质控品）上清液5ul,8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽4.5.3 PCR 扩增将准备好的PCR反应管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按下列循环参数进行扩增反应：37 °C -2min ; 94 °C -2min ; （94 °C -15ses ; 55 °C -45ses ）X40 cyclics ;EBV检测荧光素：FAM;反应体系：50ul ;荧光信号收集：55 C -45ses，末端收集。4.5.3Mx3000P荧光定量PCR仪的设置及结果分析4.5.3

6、.1打开计算机电源。4.5.3.2将Mx3000P电源开关打开，在大约1分钟的时间内，仪器将会自检并且能听到滤镜 轮转动的声音。打开电脑上的MX3000P软件，确定软件界面右下面的联机标志呈 现绿色。如果不是绿色而是红色，软件会提示用血M庞PC亡仙血咲也圮伽岀，这时只需要继续稍等片刻，待仪器自检完成, 会自动连接计算机。4.5.3.3在软件的弹出框中选择您要进行的实验类型,项“ Qua ntitive PCR(Multiple Sta ndards)” 进行绝对定量分析。4.5.3.4确定卤钨灯已经打开。（绿色）则说明卤钨灯已经打开；创（黄色）则说明卤钨灯正在预热（红色）则说明卤钨灯没有被打开

7、，这时需要用鼠标点击这个标志将光源打开。在卤钨灯已经被打开的情况下，软件界面右下方会显示（绿色）4.535最好在仪器与光源预热20分钟后开始实验。4.536 在- 里，对所选孔进行设定，在Well type 中设定Standard（标准 品）、NTC （阴性对照）、unkown （样品）等，并选择正确的荧光通道（FAM, HEX, ROX，Cy5），参比荧光（Referenee dye ）选None。对于标准品,在Well type中设定为“ Standard ”后，再设定其模板浓度。方法为：点击S tandard qudntit/:FAM4.00&+00710倍的浓度梯度可以直接点击

8、、"小 ，在下拉菜单中选择不同的系数关系后， 依次点击设定为标准品的另外几个孔，浓度将实时显示。也可以直接点击标准品的各个孔位，在StandaM中狈瞅曲 7畑一栏，手工输入浓度。若要对不同的样品进行编号则双击所选孔，在name框中输入样品号，点击Show Well Names就能显示样品编号或者点击版面右上方的,01'，导入以前使用的96孔板设定。4.537点击山小*，进行PCR循环的设定，可以直接点击温度、oi：jg时间;国日改变各项温度、时间、循环数等。在选定大步骤之后添加步骤可选定该大步骤后,点击，或点击鼠标右键，在弹出的对话框中，选择 AddSegment，则可在该大

9、步骤之后添加一个大步骤；若是在选定大步骤里面的小步 骤后边添加一小步骤，选中该小步骤，点击鼠标右键，在弹出的对话框中选择“AddDel&le，或者点Plateau with Ramp 。要删除某个大步骤，直接选定大步骤，点击界面右边的击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。如果要删除一个大步骤里的小步骤，可先选定此步骤时间和温度中间的横线，将其变红，如图D alete，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤点击lri - 1导入以前设定的PCR程序。'(END )代表在这一步结束时米集荧光信号;'(ALL)代表在这一步的全过程都采集荧光信号，一般用作熔解曲线分

10、析。可直接用鼠标将此图标拖到要采 集信号的地方。若要去除'，可将其拖出循环设定区域4.538曲曲 结束之后，点击软件界面右上方的已o会弹出对话框提示：仪器灯源正在预热，需要“马上运行”或者是“灯预热完成后再运行”？通常可直接 点击“马上运行”，但最好点击“灯预热完成后再运行”，可以保护灯源。软件界面右下方会出现运行状态显示框 Run Status，点击Start开始实验。在运行过程中可以通过点击Add Cycles来增加扩增的循环数。还可以选择勾选“ Turn lamp off at end of run ”，在PCR运行结束之后软件将自动关闭卤钨灯4.539在PCR运行的过程中可以点

11、击旳悟，观察样品的实时扩增原始结果。4.5.3.10 PCR运行结束后，点击仝三，再点击Results，软件将自动进行结果分析, 也可点击'手动进行结果分析。可以手动调节阈值线(拖动)进行分析。点 击''可显示标准曲线，看斜率、截距、线性相关是否在可控范ROX | HEX | FAM可选择相应的荧光观察扩增曲线。右边的* ”型-也也理旦世 广Plaif!帕叩由対山辟 广 Stsrdard curIntia tenpietg qiuen'jl 广 L ul cobr ssathE r pll 厂 lehtropari.厂 Ccnioliit»d ripe

12、rtt围内。左下角的*' Arnplification plots可根据自己的需要选择显示的界面Ct值列表, 标准曲线,an *» iurBrn irviiiarM n“iwa Hnitial template qiiantitij：样本起始浓度,w结果excel表格输出,ii! iwi naim 合并面板，包括设置、程序设定、样本Ct值、扩增曲线四个面板。OpticsurF.Ax.lysis Xerw Settings,.4.5311分析曲线时，如果曲线不够光滑，还能用中的 Smoothi ng对曲线进行调节，一般Amplification average是3，可按需要将其

13、调至较大数值,Anpl i f i c tt 1 on i.v*rsg：i ng如5、7、9，调整后曲线将更光滑，不过Ct值会稍中的微靠后一点，使数据失真，通常情况下，不建议这么做4.5.3.12如果需要对每条曲线进行单独的基线设置，点击Baseli ne Correctio n，点击Adaptive baseli ne，在下面对应的各孔，单独进行 基线起始和终止位置的调节4.5.3.13关于MX3000P调用前一次实验标准曲线的补充说明。 点击桌面Mx3000P的软件图标，弹出话框：选择 Multiple Experiment Analysis（多项实验结果分析）选项，点击“ 0K”，出现如

14、下对话框，建议选择“ Use common threshold ” 进行分析进算，然后点击口me年閔庇祗二导入需要一起分析的上机文件，点 击“Finish ”即可。4.5.3.14这里选择时要注意：1.两个或者多个实验结果要有相同的实验程序；2.每次程序中的循环数应该一致。在分析栏可以选择不同实验的不同反应孔进行同步分析。4.5.3.15分析质控结果：阴性质控品：EBV（FAM）Ct值=40或“ No Ct ”。阳性质控品：EBV（ FAM）Ct值33，且有较好的对数增长曲线。以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新检测。4.5.3.16记录实验数据。4.5.3.17取出结束

15、后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾桶内，以防止扩增管破裂而导致污染。4.5.4 Roche480荧光定量PCR仪的设置及结果分析4.541先打开电脑，再打开荧光定量PCR仪器，然后双击图标“口”，打开仪器数据库。4.5.4.2双击图标“阳”，启动罗氏480软件。4.5.4.3在弹出的对话框中，输入用户名和密码，进入软件设置界面。4.5.4.4在弹出的界面中，点击 '”，进入新的实验设置界面:4.5.4.5在“”菜单栏里，“ I询I”子菜单下。4.5.4.6 将“ Detection Format ”选择为Daul或3 color的探针杂交类型。设置为“ 50

16、ul4.5.4.7 将“ Reaction Volume4.5.4.8在“ Programs ”下：通过“”“ ”来增加总的循环阶段及阶段的循环数，并在“变性一延伸一退火”循环阶段的An alysis Mode ” 下选择 Quan tificati on4.549在“Temperature Targets ”下：通过“”“”来增加每个循环阶段里的小步骤，并在采集荧光的小步骤的“ Acquisition Mode”里选择“ single ”，采集卄、/,光。4.5.4.10在“曰”菜单栏下，通过“增加或者减少实验项目类型，通过右边的孔位选择，设置不同项目的区域，然后点击“Apply ”保存。4

17、.5.4.11在“”菜单栏下，Step 1处，选择“ Abs Qua nt ”； Step 2处，编辑标准品及 样本。4.5.4.12标准品设置：在Step 2下的96孔面板中，选中标准品反应孔，然后选择右侧的模板检测通道，如! “483-533 ”，然后将下方孔位的“Quantification Sample Type'选择为“ Standard ”，并在“ Concentration ”处输入其浓度即可。4.5.4.13样本设置：类似于标准品设置，但仅需要编辑其“Sample Name ”即可。4.5.4.14返回“ ”菜单，在“呗叭zI”子菜单右下角点击“”，运行实验。4.5.4

18、.15实验结束后，在“ 一”菜单下，选择“ Abs Quant/Fit Points ”，进入结果分析界面:【Analysis】：在此菜单下对阈值线进行调整；【Noise Band】：对实验的信噪比进行调整；【Filter Comb】：对不同荧光通道进行选择；【Std Curve】：对定量参考品进行选择，包括实验中的参考品、导入的标准品等；4.5416在上述操作完成后，点击“ MTW”；在菜单中，根据需要选择报告中需包含的项目，然后得出结果。4.5.4.17分析质控结果：阴性质控品：EBV(FAM)Ct值=40或“ No Ct ”。阳性质控品：EBV( FAM)Ct值33。以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新检测。4.5.4.18记录实验数据。4.5.4.20取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾桶内，以防止扩增管破裂而导致污染。4.5.4.21关闭扩增仪电源和计算机电源4.6结果判定EBV阳性：（EBV-FAM ） Ct <36，且有较好的对数增长曲线。EBV 阴性:（EBV -FAM）Ct 值=40 或者 “ No Ct ” （Mx3000P）或者 “ Un det. ”