高级生化实验报告记录二

1、高级生化实验报告记录二作者:日期:实验二Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反 应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利 用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern blotting。之后， James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授又发明了 RNA杂交检测技 术，因与 Southern blotting 相似，故命名为 Northern blotting。 George Stark

2、 这位 教授在两年后又开发出类似的蛋白质检测方法。1981年，在Neal Burnette所著的Analytical Biochemistry中，首次将单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Western blotting。此后开发的 Eastern blotting 是 Western blotting 的变形，对双向 电泳后蛋白质分子的印迹分析称为 Eastern blotting。30多年来，Western blotting 技术已成为蛋白质研究中最常用的工具，用于鉴定目的蛋白是否存在（定性）， 目的蛋白质的表达量和不同样品之间的表达差异性（定量）。pET系统是在大肠杆菌（Escheri

3、chia coli）中克隆表达目的基因、产生重组 蛋白的经典表达系统。目的基因被克隆到 pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录 及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。T7 RNA聚合酶 被充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。目的蛋白可用于进一步的SDS-PAGE分析、Western blotting检测或亲和层析分离纯化。二、实验目的利用Western Blotting技术，定性检测苦养二氢黄酮醇4-还原酶基因（FtDFR） 在E.coli BL（DE3）中的诱导表达。三、实验原理采用PCR技术

4、，在苦养FtDFR基因ORF起始密码子前引入Kpn ?酶切位 点，终止密码后引入Sal I酶切位点。PCR产物与pET-30b（ +）质粒进行体外重 组，获得重组质粒pET-30b- FtDFR，设计其表达产物在N-末端含有6 XHis标签。 重组质粒经鉴定后转化表达宿主菌 E.coli BL21（DE3）并使用IPTG进行诱导表 达，分别收集诱导0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的产物，经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或 Western blotting分析。Western blotting的实验流程如下：蛋白质首先通过 SDS-PAGE凝胶电泳分 离，进一步通过电泳转移

5、到固相支持物上(硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜)；将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定后含有特定抗 原的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体发生抗原 -抗体反应，并通过放 射、生色或化学发光的方法进行定位。本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体(Anti-His tag IgG，一抗)与重组FtDFR蛋白的N-末端的6 X His发生抗原-抗体特异反应，利用辣根过氧化物酶 标记羊抗小鼠IgG (peroxidase-Goat Anti- Mouse IgG，二抗)与一抗发生特异结 合，最后使用DAB进行显色。DAB 即:二氨基联苯胺(3, 3'-diaminobe

6、nzidine), 是过氧化物酶(Peroxidase的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而 呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶 的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Wester n blotti ng等膜显色中应用广泛。四、操作步骤1样品的制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为 定性检测大肠杆菌重组蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。1.1材料与试剂：基因工程菌重组 E. coli BL21(DE3)pET-30b(+)-FtDFR ；LB固体培养基(Kan 50卩g/mLLB液

7、体培养基(10mL、50mL)Kan (50 mg/mL)IPTG (24 mg/mL)PBS 缓冲液：137mM NaCl， 2.7mM KCl， 10mM Na2HPO4,2mM KH2HPO4,pH7.4;5X SDS上样缓冲液(pH8.0): 250mM Tris-HCI(pH6.8)，10%( W/V) SDS，0.5%( W/V )溴酚蓝，50%( W/V)甘油，5%( W/V )B -巯基乙醇；1.2仪器与设备:恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、酒精灯、消毒酒精（75%）、棉球、接种环、台式离心机、Tip（ 10讥200讥1 mL）、微量加样器（10 L 200讥1 mL）、离心

8、管（1.5 mL）。1.3操作步骤： 将基因工程菌E. coli BL21（DE3）PE30b（+）-FtDFR划线于lb固体培养基（Kan 抗性），37E培养16 h0 挑选单菌落，接种至10 mL LB培养基（按0.1%加入Kan, 10卩L于37 C 过夜培养，即为种子液。 按2 %的接种量（1 mL）将种子液接种到50 mL LB Kan培养基中（按0.1% 加入 Kan, 50 小，于 37 C培养 OD600 至 0.5 （约 2.5 h）。 加入IPTG至终浓度为1 mmol/L （100小，置于22-25E连续诱导表达8 h，分别取诱导前0 h，诱导后2 h、4 h、6 h和8

9、 h的培养液1 mL于1.5 mL离心 管中，置于4C备用。 诱导完毕后，各样品于12000 rpm离心5 min收集沉淀，用等体积PBS（ 1 mL、重悬漂洗细胞2次，收集菌体。 各管分别加入80卩L PBS重悬细胞，加入20卩L 5 X SD上样缓冲液，混 匀后置于沸水浴中10 min， 12000 rpm离心3 min后，置于4°C备用。1.4注意事项： 重组蛋白的诱导表达应进行正确的无菌操作并加入适宜浓度的抗生素，避免可能的污染。 制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰。 多次使用时样品应进行分装，保存于-20 C或-80C且避免反复冻融。2 SDS-P

10、AGESDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAG1、是一种常用的定性分析蛋白质的电 泳方法，多用于分离蛋白质或测定蛋白质相对分子质量。十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，能破坏蛋白质分子间的 非共价键，使白质变性而改变原有的空间构象。在强还原剂（如B-巯基乙醇或二硫苏糖醇）存在的情况下，蛋白质分子内的二硫键被打开，蛋白质的空间构象可进一步改变。此时，SDS以其疏水基和蛋白质的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的蛋白质-SDS复合物。据计算，结合到蛋白质分子上的 SDS分子数目和 蛋白质的氨基酸残基比值一般为 1： 2。这种复合物由于结合了大量的 SDS，所 引入的净电荷大大超过了蛋白

11、质原有的净电荷(约 10倍)，使蛋白质丧失了原 有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小但屏蔽了蛋白质天然电荷差异的负离 子复合物，因而各SDS-蛋白质复合物具有均一的电荷密度，相同的荷质比，其 电泳迁移率主要取决于蛋白质自身的分子质量，而与其所带电荷和形状无关。当蛋白质相对分子质量在11700-200000之间时，电泳迁移率与分子质量的 对数呈直线关系，符合以下方程式：lgMw=-bmR+K式中，Mw为蛋白质相对分子质量；b为斜率，mR为电泳相对迁移率，K为 节距。在一定条件下，K和b均为常数，基于这一关系，通过测定几个标准蛋白 质(即相对分子质量已知)的迁移率，可得一条标准曲线。未知蛋白质在

12、相同条 件下进行电泳，测得它的相对迁移率，即可在标准曲线上求得其相对分子质量。 2.1材料与试剂： 分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCI，0.4% SDS, pH 8.8)。 浓缩胶缓冲液(0.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS, pH 6.8)。 30%丙烯酰胺/N, N'-亚甲基双丙烯酰胺(Arc/Bis): 29.2 g Acr, 0.8 g Bis， 定容至100 mLo TEMED (四甲基乙二胺)。 2X SDS 上样缓冲液(pH8.0): 250mM Tris-HCI(pH6.8)，10% (W/V ) SDS，0.5%( W/V )溴酚蓝，

13、50%( W/V)甘油，5%( W/V )B -巯基乙醇。 电极缓冲液(pH 8.3): 3.03 g Tris，14.41 g Gly，1.0 g SDS，调整 pH 后定容 至 1000 mLo 电极缓冲液(3.03gTris, 14.41gGly, 1.0gSDS,调整 pH=8.3 定容至 1000ml) 封底胶：1g琼脂糖溶于100ml电极缓冲液。 染色液：45%甲醇，10%乙酸，0.25%考马斯亮蓝R-250o 脱色液：10% (V/V )乙酸，5% (V/V )乙醇。预染标准分子量蛋白质 Marker。2.2仪器与设备：MV-川型小型单垂直板电泳槽及附件、电炉、电泳仪、微量加样器

14、（10uL,Tip （10 uL。2.3操作步骤： 制胶槽的安装：将成套的两块玻璃板放置于制胶槽背面上的支架固定（凹形玻璃板向外），4个铁夹分别夹在玻璃板左右两侧即可制胶。 SDS-PAGE分离范围一般在10-200 kDa,超过这个范围无法进行准确比较。不同的凝胶浓度适用于不同的相对分子质量范围，根据蛋白质相对分子质量选择最适的凝胶浓度，如下表所示。本实验选用12.5%的分离胶对重组FtDFR（约 40 kDa）进行分离。试剂分离胶浓缩胶浓度7.5%10%12.5%15%30%4%分离胶缓冲液mL4.04.02.04.04.0-浓缩胶缓冲液mL-0.625Acr/Bis mL4.05.33.

15、358.010.70.375H2O mL8.06.72.654.01.31.510% AP mL0.30.30.150.30.30.075TEMED mL0.0080.0080.0080.0080.0080.005 制胶：配制12.5%的分离胶，灌入两玻璃板之间，加至凹形玻璃板顶端2cm处，立即覆盖5mm左右水层，静置聚合。当分离胶与水层之间的界面重新出现 时表明已胶已聚合。小心倒掉分离胶上水层，配制4%浓缩胶后加入玻璃板中，插入梳子并及时补充由于浓缩胶聚合产生的空隙。 电泳槽安装：浓缩胶聚合后，除去4个铁夹，正确安装进入电泳槽（凹形 玻璃板向内）并用白色塑料夹将玻璃板固定。 点样：分别于内外

16、槽加入适量电极缓冲液，使内槽水位超过凹形板缺口。使用微量加样器分别于制胶孔中加入诱导后的样品4-5 yL,预染标准分子量蛋白质点10 yL 电泳：接通电源，待指示剂在分离胶中迁移 5cm时，停止电泳。 剥胶：小心剥胶，将浓缩胶（浓缩胶影响操作）和分离胶上不用的部分切 去（便于识别）。Western Blotting做到此处为止。 染色：凝胶加入适量染色液，电炉加热处理 15 min染色。 脱色：使用蒸馏水漂洗取出染色液，加入脱色液，电炉加热脱色至出现清 晰的蛋白条带。2.4注意事项： 上样总体积一般5-10 L左右，胶孔的最大限度可加15 L样品。 微量加样器应贴壁吸取样品，避免吸进气泡；将微

17、量加样器Tip头插至加 样孔中缓慢加入样品，避免样品溢出。 电泳设备应注意检查正负极、是否短路或接触不良、是否漏液、电流电压 大小（电流强度会随电泳的进行有所降低）。 电极缓冲液、TEMD和AP应新鲜配制。3转膜与杂交杂交膜的选择是决定 Western blotting成败的重要环节。应根据杂交方案、被 转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC）和聚偏氟乙烯膜（PVDF）。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环 境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起；

18、在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。PVDF膜灵敏度高、 分辨率和蛋白亲和力比NC膜高，非常适合于低分子量蛋白的检测。PVDF膜在使 用前必须用纯甲醇浸泡饱和5 sec,以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电 的蛋白结合。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜或PVDF膜。随着膜孔 径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用 0.45 yn和0.2 ym两种 规格的NC膜和PVDF膜。大于20kDa的蛋白可用0.45y m的膜，小于20kDa的蛋白用0.2 m的膜。蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转和半干转移。前者 操作容易，转移效率高；而后者适用

19、于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。以下为 槽式湿转的操作步骤。3.1材料与试剂： 材料：PVDF膜（0.45 m,进口分装），Whatman滤纸（进口分装）， 搪瓷盘，一次性PE手套，镊子，玻棒，Western blotting DAB显色法试剂盒。 试剂：转移缓冲液 pH 8.3（25 mmol/L Tris ,0.2 M 甘氨酸，20%甲醇）1000 mL;10X TBS缓冲液 pH 7.6（24.2 g Tris base 80 g NaCI,用 1N HCl 调 pH=7.6）;脱脂奶粉、BSA或试剂盒自带的蛋白质干粉；洗涤缓冲液（1X TBS，0.1% Tween-20）;封闭缓冲液/

20、抗体稀释液（1X TBS，0.1% Tween-20, 5% w/v脱脂奶粉）。3.2仪器与设备：转膜电泳仪及其附件，电泳仪、杂交仪，方形培养皿，凝胶成像系统。3.3操作步骤：转膜 将PVDF膜在甲醇溶液中浸泡5sec使膜表面充分和甲醇接触（可观察到 膜变为半透明）。 准备转移缓冲液，依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，将凝胶和NC膜和滤 纸放入转移缓冲液中平衡5min。 装配转移三明治（海绵-3层滤纸一胶一膜一 3层滤纸-海绵），在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜； 将夹子打开使一面保持水平（规定为正极）。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回 擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去 其中的气泡。依次加膜、加胶，再在膜上盖3张滤纸并除去气泡。 注入转移缓冲液，放入转印三明治，接通冷凝装置，于 100V电泳45min （电流约为0.3 A）。 电泳结束，观察预染的蛋白质 Marker是否转移到膜上