反相高效液相色谱法快速测定长春花中4种生物碱

1、第1期罗猛等：反相高效液相色谱法快速测定长春花中4种生物碱89第33卷2005年1月分析化学(FENX I HUAXUE )研究简报Chinese Journal of Analytical Chem istry第1期87 89第1期罗猛等：反相高效液相色谱法快速测定长春花中4种生物碱89第1期罗猛等：反相高效液相色谱法快速测定长春花中4种生物碱89反相高效液相色谱法快速测定长春花中4种生物碱罗猛付玉杰祖元刚3史权牟浪松李庆勇（东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨150040 ）摘要采用反相高效液相色谱法同时分离测定4种长春花吲哚类生物碱。以水二乙胺=986 ：14,用磷酸调节p

2、H =7 2（溶液A）,甲醇 乙腈 =4 1 （溶液B）,380 mLA和620 mL B混合作为流动相，流速2 mL /m in, 进样量10 gL, 220 nm下检测，以恒流洗脱方式在 25 m in内分离了长春碱等 4种成分。同时还研究了流动相 组成、pH值等对分离效果的影响。对实际样品分析，取得了较好结果。关键词反相高效液相色谱，吲哚类生物碱1引 言长春碱（V i nblasti ne）、长春新碱（Vi ncrist in e）、长春质碱 （Cathara nthi ne）、文多灵（Vi ndoli ne）是夹竹 桃科植物长春花（Catharanthus roseusL. G Don

3、）中所含有的4种重要的吲哚类生物碱。其中长春碱和 长春新碱是目前世界上应用广泛的抗肿瘤药物，长春质碱、文多灵是合成长春碱的前体，长春质碱有一定的降血糖作用，文多灵有镇痛和利尿的功效。目前长春碱类生物碱主要还是从长春花植物中提取，建立长春花中这 4种生物碱的快速检测对长春花GAP种植和建立质量评价体系具有重要意义。已经报道的长春碱类生物碱的含量测定方法有薄层扫描法2,3、高效液相色谱法4,5及放射性免疫测定法6,7等。但对4种生物碱同时测定，国内尚未见报道。本研究在以往文献811的基础上，建立了快速测定4种吲哚类生物碱的反相高效液相色谱方法，在实际样品的分析中取得了满意的结果。2实验部分2 1仪

4、器与试剂JASCO高效液相色谱仪（日本JASCO公司）,1580泵，1575型紫外检测器，Version 6. 1色谱工作站； PB220型精密pH计（上海雷磁仪器厂）;BS210S型电子天平（北京Sartorious有限公司）;M 250型玻璃过 滤器（上海玻璃仪器厂）;UV 22550紫外 可见分光光度计（日本岛津公司）。长春碱、长春新碱（纯度 99% , Sigma公司），长春质碱、文多灵（纯度 95%,浙江海正药业股份有限公司）；长春花样品采自海南省海口市；乙腈、甲醇均为色谱纯；磷酸、二乙胺为分析纯；水为二次蒸馏水。所有试剂使用前均经 0145 gm的微孔滤膜过滤。2 2对照品与样品配

5、制精确称取适量长春碱、长春新碱、长春质碱、文多灵对照品，用5 mL甲醇溶解并定溶于 25 mL容量瓶，摇匀，所配制的浓度分别为0.5、0.50.5和1. 0 g/L。取长春花全株粉末10 g,室温下分别用60、40、20 mL甲醇超声提取40、30、20 min,过滤，合并提取液，50C减压蒸发，经0.45 gm的微孔滤膜过滤，滤液定容至50 mL。所有样品保存于 4 C冰箱中备用。2. 3色谱条件色谱柱：DiamonsiF G8ODS（250 mm M. 6mm i d , 5 gm）;流动相为水 二乙胺=986 14,用磷酸 调节pH =7. 2（溶液A）;甲醇 乙腈=4 ：（溶液B ）

6、, 380 mL A和620 mL B混合作为流动相；流速为2 mL/min;进样量:10 gL;柱温：23 C；检测波长：220 nm。3结果与讨论3 1流动相的组成对分离效果的影响200321125 收稿;20042042）7 接受本文系科技部中德国际合作项目（No. CHN02 /329）、教育部重点基金项目（No. 104191 ）和哈尔滨重点科技攻关项目（No.2003AA3CS112 ）资助实验表明，流动相中甲醇和乙腈的比例对峰形有较大影响，随着甲醇比例的升高，分离物出现严重脱尾现象。当甲醇乙腈达到4：时,峰形良好。同时，在流动相中选择二乙胺磷酸溶液为缓冲体系并通过调节溶液 A与溶

7、液B的比例使 4种物质得到较好的分离。在实验中，当A与B的比例大于38 62时，最后出峰的长春碱保留时间延长；当A与B的比例小于38 62时，长春新碱与长春质碱峰形交叉，不能得到较好的分离。因此，A与B的比例在38 62时较为适宜。3. 2流动相的pH值对分离效果的影响实验以缓冲溶液调整流动相的pH值。将缓冲溶液的pH值分别设为68、7.0、7.2、74、7.6、7.8和8 0,观察pH值对峰形及分离效果的影响。结果表明：当缓冲溶液pH值为7. 2时，各峰间分离度增大，峰形较好。因此，选择缓冲溶液pH值为7 2。3. 3流动相的流速对分离效果的影响流动相的流速对各物质的保留时间有较大影响。分别

8、设定1. 0、115、2 0mL/min，长春碱在前两个流速下保留时间分别在42和33 m in左右，使检测时间延长，而当流速为 2. 0 mL/min时，4种物质可在25 min内即可完成分离。考虑到加大流速对色谱 柱及液相系统的影响以及所确定检测条件的普适性，因此选择流动相的流速为 2 mL /m in。3. 4色谱图和校正曲线图1为4种长春碱类生物碱对照品混合样品的RP2HPLC色谱图。由图中可以看出,4种生物碱得到了很好的分离 ，且峰形良 好。由回归分析得到的 4种组分的校正曲线列于表 1。以3倍信 噪比求得检出限。由表1可以看出峰面积与样品浓度呈良好的r/m in图14种长春花生物碱

9、的色谱图Fig 1 Chromatogram for 4 vinca alka2bids1.文多灵(vindoline ) ; 2.长春质碱 (cath02 ranthine) ; 3.长春新碱(vincristine ); 4.长春 碱(vinblastine)。线性关系，线性范围适当，检出限低。在上述色谱条件下，注入供试品溶液，平均理论塔板数大于1500,相邻各峰间的分离度大于1. 5。表14种长春花生物碱标准曲线的回归分析及检出限Table 1 Regression analysis of calibrati on curves and detection lim it of 4 Cat

10、haranthus roseusalkaloids生物碱标准品回归方程相关系数线性范围（g/L）检出限(g/L )A lkaloidsRegression equations(r)L inear rangeDetecti on lim it长春碱 V inblastineY =22489190. 9565X +130543. 86960. 99970. 060. 50.021长春新碱V incristineY = 16186790. 5771X + 205465. 30430. 99990. 010. 50.003长春质碱 CatharanthineY =28504756. 3636X +43

11、1144. 00000. 99620. 10. 50.042文多灵VindolineY = 12369067. 0040X + 86367. 91300. 99980. 11. 00.042X：浓度(concentration) , g/L; Y：峰面积(peak area)3. 5方法的精密度和重现性在上述色谱条件下，对同一对照品溶液，重复测定5次后证实4种物质在此测定方法下，峰保留时 间波动小于 0 1 min,测得峰面积的 RSD为：长春碱0. 011%;长春新碱0. 035% ;长春质碱 0. 091% ;文 多灵0 011%。对同一批样品按供试品溶液的制备方法平行制备5份,分别进样1

12、0uL ,同时取混合对照品溶液10 UL进样测定，按外标法测定其含量并计算RSD,长春碱为1. 01%;长春新碱为0157% ;长春质碱为 0158%;文多灵为1. 52%。3. 6供试样品的稳定性取混合对照品以甲醇配制成对照品储备液，置冰箱4C保存。在上述色谱条件下 ，对同一供试品,在保存0、6、12、24、48 h后，用当日新配制的对照品溶液按外标法测定，并计算其 RSD小于2 0% ,说明供试品在48 h内稳定。3. 7实际样品分析在上述色谱条件下，对2. 2所制备的实际样品溶液进行检测。以标准加入法测定其加样回收率，所 得结果列于表 2。本方法定量准确、迅速、重现性好。表2实际样品分析

13、结果Table 2 Analytical results ofthe alkaloids of Catharanthusroseus样品加入量测得量回收率相对标准偏差SamplesAdded （g/L）Found （g/L ）Recovery （% ）RSD （% , n = 3）00. 076580-2. 32长春碱 V inblastine0. 020. 09619499. 62. 730. 040. 116813100. 21. 9800. 010820-2. 16长春新碱V incristine0. 020. 03075899. 82. 590. 040. 050871100. 11.

14、 9900. 182880-2. 97长春质碱 Catharanthine0. 100. 27778898. 23. 110. 200. 38249799. 93. 0200. 487239-2. 82文多灵V indoline0. 100. 57314597. 63. 040. 200. 68242899. 32. 98Refere nces1 Pennanen S, Huhtikangas A. Photochem. and Photobiology, 1990, 51 （5）: 5155182 Tam M N, N ikolovaQamyanora B, Pyuskyuler B. J.

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19、o Meng, Fu Yujie, Zu Yuangang , Shi Quan, Mu Fansong, L i Q ingyong（Key Laboratory of Forest Plant Ecology, M inistry of Education, N ortheast Forestry U niversity, Harbin 150040 ）Abstract A method for the rapid detem ination of 4 vinca alkaloids by reversed phase high performanee liquid chromatography （RP2HPLC） was proposed These4