细胞周期分析方法

1、细胞周期分析方法 在每一个生命体中都存在着一个“生物钟”，它打算了细胞的生长、分裂、分化或死亡。这个所谓的生物钟就是细胞周期调控机制（cell cycle control)。正常机体的生物钟，在胚胎期的细胞周期保持迅速地运行，成年细胞的细胞周期运行则放慢，而神经元的细胞周期几乎是不运行。细胞生长中的细胞周期发生异样，则会导致细胞死亡。当细胞周期的调控发生紊乱时会浮现细胞的增殖与分化异样，可导致肿瘤的发生。了解和把握细胞周期的逻辑与技术，对细胞培养也是非常重要的。 一、细胞周期 在细胞培养体系中，单个细胞表现有很强的自立性。一个有活力的细胞必需通过细胞周期举行倍增，繁殖成群体。群体细胞才是培养细

2、胞存在的基本形式，而且在形态和功能上互相依存。细胞周期是细胞的增殖过程，先经过一个间期，主要是遗传物质dna的复制合成过程；然后进入分裂（mitosis,m）期，主要完成细胞遗传物质的分配。m期之后是细胞的分裂后期，因刚分裂的子代细胞变幻主要是与dna的合成相关，如合成dna聚合酶及mrna等，故又称dna合成前（presynthetic gapl period, g,）期。接着进入dna合成（synthe-tise,s)期，此期可在显微镜下见到细胞核的某些变幻，但最好是用发射性核素标志法检测dna合成期的核苷酸掺入量。s期dna最易受损，易受到致突变或致癌物质的伤害作用。s期之后为g2期，也

3、称分裂前期，此时dna经复制而使含量加倍，rna合成及染色质的螺旋化，然后进入下一次的分裂（m）期。综上，细胞周期是由间期和分裂期构成，并互相交替的举行性过程。间期是由g1期、s期和g2期组成，进入m期完成细胞的分裂增殖。表3-1为不同来源的细胞在各细胞周期阶段中的持续时光。 二、细胞培养的生长过程和生命期 1细胞培养的生长过程细胞在体外培养需传代，传代培养是将细胞从一个培养瓶皿转种到另一瓶皿内生长。细胞从传代转种，直至下一次传代再培养的一段时光称一代（gen-eration)；单个细胞延续两次分裂的间隔时光称细胞一代时光（cell generation time)。普通细胞接种后，作为群体细

4、胞要经过埋伏期、对数生长久和静止期等三个阶段，这是每一个细胞系所共有的特征。细胞接种后呈悬浮状态，贴壁细胞很快会贴附于培养瓶壁，各种细胞需经过埋伏期（g1期），以适应环境条件，也是培养细胞对在制备中引起损伤的修复过程。埋伏期长短不同，原代细胞需2496小时，肿瘤细胞或无限传代细胞仅需224小时。细胞分裂象逐渐增多，标记着进入指数（或对数）生长久。在对数生长久举行计数的细胞增强一倍，如正当此期的细胞数由1×106增强到2×106个细胞所需要的时光称为群体倍增时光(population doubling time)，但此时光与细胞一代时光并非同义。对数生长久是细胞经埋伏期后浮现

5、的细胞数目指数增强的阶段，其分裂数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要指标，以细胞分裂指数（mitotic index, mi)来表示。mi是计数100个培养细胞中的有分裂象的细胞数，普通细胞的mi为0.20.5%，无限传代细胞系或肿瘤细胞的mi可高达35%。如接种细胞数量相宜，此期持续35天后，细胞数量增多，贴壁细胞可互相接触连成片，因正常细胞的分裂发生接触抑制而形成单层细胞，但肿瘤细胞没有接触抑制，可导致细胞形成多层重叠。悬浮细胞因为细胞密度增大，培养液中的养分成分大量消耗，代谢终末产物蓄积，细胞进入静止期，尽管代谢活动未停，但不再增殖。静止期的细胞应举行传代，否则随着培养环境的恶劣变幻

6、会发生细胞中毒，变性，重则死亡脱壁。 2培养细胞的生命期体内组织细胞的生存期应与完整机体的诞生、成长、年轻、死亡相全都，但离体培养的细胞，其生命期则有很大变幻。培养细胞的生存过程普通要经受原代期、传代期和衰退期。从体内取出组织制备的细胞接种到培养瓶皿的第一次培养称原代培养，因细胞刚刚离体，与体内原组织很相像，具异质性，互相依存性强，但不同类型的细胞，其生长率不同，细胞克隆形成率较低。原代培养物所含细胞类型，在培养生长过程中呈动态变幻，向来到不能继续生长为止。此时细胞必需传代培养，第一次传代后，原代培养物变成细胞系，每当传代后，增殖能力强的细胞群体占优势，不增殖或缓慢增殖的细胞群体逐渐削减，至死

7、亡。这种现象在第一次传代后最为显著，经过这样的挑选生长后，细胞类型数目削减。原代细胞普通只能传13代，相当于615个细胞周期，历时24周便年轻死亡。传代期在全生命期中持续时光最长，特点是细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。假如呈二倍体核型并获得有限传代的细胞系称二倍体细胞系，这些细胞系往往来自间充质，即来自结缔组织的成纤维细胞或来自血管的成分，成为成纤维细胞的过度生长。二倍体成纤维细胞于体外可传3050代，相当于150300个细胞周期，可历时1年左右。当传代临近生存期限时，细胞增殖缓慢以致彻低停止，进入衰退期，最后死亡。这种主动结束自身生命活动的生理过程叫程序性死亡（programmed cel

8、l death)，也称为凋亡（apoptosis)。 大多数细胞系是以不变的形式举行有限传代，当超过一定代数后，则趋向年轻以至于死亡。有些细胞系传代一定代数，此期可能发生自发或诱发转化，获得不死性而成为无限传代细胞系。转化细胞系通常有如下特点：细胞形态学发生变幻，如细胞体积变小，变圆，具有较高的核质比例；生长倍率增强，倍增时光削减，从3648小时减至1236小时；对血清的依靠性降低；细胞黏附性削减，降低贴壁依靠性，增强克隆效率；染色体异倍体（细胞之间的染色体变异）和非整倍体（与供体细胞核型不同）的细胞数增强；细胞接种到动物体内，致癌率上升。 三、细胞周期分析 传统的细胞周期分析主要基于两种生物技术，一是细胞的同步化，二是s期或m期始末时光的观看。将两者结合起来，对同步化细胞进入s期或m期的时光计算，举行细胞周期分析。直至流式细胞术将细胞周期素（cyclins）和dna双参数分析等新的细胞周期分析办法被发觉，使细胞周期分析开头不再