生物化学实验讲义

1、生物化学实验讲义2009年5月实验一 糖的颜色反应和还原反应1糖的颜色反应实验目的及要求 1. 掌握莫式（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。2. 掌握塞式（Seliwanoff）试验鉴定酮糖的原理和方法。3. 掌握杜式(Tollen)试验鉴定戊糖的原理和方法。实验原理1莫式试验：糖经无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与-萘酚生成紫红色缩合物。2塞式试验：酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕红色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。3杜式试验：戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃

2、红色物质。实验仪器及用品仪器：水浴锅。器皿：吸管、试管。实验药品：蔗糖、葡萄糖、淀粉、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、-萘酚、浓硫酸、95%乙醇、间苯二酚、盐酸、间苯三酚。实验试剂 莫式试剂：-萘酚5g,溶于95%乙醇并稀释至100ml。现用现配，并贮于棕色试剂瓶中。 塞式试剂：间苯二酚50mg，溶于100ml盐酸（VH2O：VHCl=2:1），现用现配。 杜式试剂：2%间苯三酚乙醇溶液（2g间苯三酚溶于100ml95%乙醇中）3ml,缓缓加入浓盐酸15ml及蒸馏水9ml。临用时配制。实验内容及步骤一、莫式实验于4支试管中，分别加入1 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或

3、滤纸浸在1 ml水中），然后各加莫式试剂2滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5 ml（切勿振摇！），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。二、塞式试验于4支试管中，分别加入0.5 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液，然后各加塞式试剂2.5ml，摇匀，同时置沸水浴内，比较各管颜色及红色出现的先后顺序。 三、杜式试验于3支试管中加入杜式试剂1ml，再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液，混匀。将试管同时放入沸水浴中，观察颜色的变化，并记录颜色变化的时间。四、实验现象记录仔细观察实验中的颜色变化，对于塞式试验和杜式试验还需记

4、录下颜色变化的时间。2糖的还原反应实验目的及要求 掌握糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法。实验原理费林(Fehling)试剂和本尼迪(Benedict)试剂均为含Cu2+的碱性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色或黄色的Cu2O，此法常用作还原糖的定性或定量测定。实验仪器及用品实验仪器：水浴锅实验器皿：吸管、试管实验试剂：硫酸酮、氢氧化钠、酒石酸钾钠、柠檬酸钠、无水碳酸钠、淀粉、蔗糖、葡萄糖。实验试剂1. 费林试剂试剂A：CuSO4·5H2O 34.5 g,溶于蒸馏水并稀释至500 ml。试剂B：氢氧化钠125 g，酒石酸钾钠137 g，溶于蒸馏水并稀释至500

5、ml。临用时将试剂A与试剂B等体积混合。2. 本尼迪试剂：柠檬酸钠（Na3C6H3O7·11H2O）及50 g无水碳酸钠，溶于400 ml蒸馏水中。另溶解8.5 g硫酸铜于50 ml热水中。将硫酸铜溶液缓缓加入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤。此混合液可长期使用。实验内容及步骤于3支试管中加入费林试剂A和B各1 ml，混匀，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1 ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化。另取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1 ml，然后每支试管加本尼迪试剂2 ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，

6、冷却，和上面结果比较。实验二 3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量一、目的 通过本实验，掌握还原糖定量测定的基本原理，练习比色定糖法的基本操作，熟悉分光光度计的使用方法。 二、原理 在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，520nm 波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖的含量。三、试剂1 1mg/ml葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80烘至恒重），置于小烧杯中，用

7、少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。 23,5-二硝基水杨酸试剂：甲试剂为6.9g结晶酚溶于15.2ml10%NaOH溶液中并用水稀释至69ml，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠。乙试剂为255g酒石酸钾钠溶于300ml10%NaOH溶液中，再加入880ml 1% 3,5-二硝基水杨酸溶液。将甲、乙二液混合贮于棕色瓶中，室温放7-10天后使用。3待测还原糖溶液四、操作步骤 制作葡萄糖标准曲线并测定待样品中还原糖含量 取12支大试管，编号，按下表操作。管号012345678样品样品样品葡萄糖溶液（ml）00.20.40.60.81.01.2

8、1.41.6000待测液（ml）0000000001.01.01.0蒸馏水（ml）2.01.81.61.41.21.00.80.60.41.01.01.0水杨酸试剂（ml）1.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.5沸水浴5min，取出立即冷水冷至室温，加水21.5ml，混匀OD520nm以吸光度为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线，然后根据标准曲线，查出相应的还原糖毫克数，换算成浓度单位即为样品的还原糖浓度。 五、注意事项 标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。 实验三 蛋白质的颜色反应和沉淀反应蛋白质的颜色反应实验目的及要求 1掌握鉴定

9、蛋白质的原理和方法。2熟悉蛋白质的沉淀反应。3进一步掌握蛋白质的相关性质。一颜色反应蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白质物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果来决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用蛋白质定量测定的依据。实验试剂及材料1卵清蛋白液：将鸡蛋白用蒸馏水稀释20-40倍，2-3层纱布过滤，滤液冷藏备用。2米伦试剂：40gHg溶于60ml浓硝酸，水浴加温助溶，溶解后加两倍体积蒸馏水，混匀，静置澄清，取上清液备用，此试剂可长期保存。3粉末状尿素410%

10、NaOH51%硫酸铜溶液60.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100ml。7浓硝酸实验原理米伦反应：米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物，能与苯酚及某些二羟苯衍生物起颜色反应，生成红色的邻醌肟类化合物。组成蛋白质的氨基酸只有酪氨酸为羟苯衍生物，因此具有此反应者即为酪氨酸存在之确证。双缩脲反应：将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故能呈此反应。该反应可用于蛋白质的定性及定量测定。黄色反应：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。

11、遇硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝苯衍生物。茚三酮反应：蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及除脯氨酸和羟脯氨酸外的-氨基酸所共有。含氨基酸的其他物质亦呈此反应。 实验内容及步骤1米伦反应（1）置0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加米伦试剂约0.5ml，小心加热，观察颜色变化。（2）取2ml蛋白溶液，加0.5ml米伦试剂，此时蛋白沉淀，小心加热，观察现象。2. 双缩脲反应（1）取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩脲，释出的氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10%NaOH

12、溶液1ml摇匀，再加2滴1%CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。（2）另取一支试管，加蛋白质溶液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1% CuSO4溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。3. 黄色反应于一试管内，加入蛋白质溶液10滴及浓硝酸3-4滴，加热，冷却后再加10%NaOH溶液5滴，观察颜色变化。4. 茚三酮反应取1ml蛋白质溶液置于烧杯中，加2滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。二沉淀反应实验原理多数蛋白质在水溶液中由于其分子表面可形成水化层及双电层而成为稳定的亲水胶体溶液，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。蛋白质盐析作用：向蛋白质溶液中

13、加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析。当降低盐类浓度时，该沉淀又能溶解，这是一可逆过程。乙醇沉淀蛋白质：乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质质点的水化层使其沉淀出来。重金属盐沉淀蛋白质：蛋白质与重金属离子结合成不溶性复合物而沉淀。生物碱试剂沉淀蛋白质：植物体内具有显著生理作用的含碱性化合物称为生物碱，能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团，所以能与生物碱试剂结合生成沉淀。实验试剂及材料1 蛋白质试液：见一2 粉末状硫酸铵结晶体3 饱和硫酸铵溶液：4 95%乙醇5 1%醋酸铅6 5%鞣酸溶液7 1%硫酸铜溶液8 饱

14、和苦味酸溶液9 1%醋酸溶液。实验内容及步骤1蛋白质盐析作用（1）取蛋白质溶液5ml，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合静置几分钟，球蛋白即析出。倒出少量沉淀加少量水，观察是否溶解。（2）将上述混合液过滤，滤液中加硫酸铵粉末，至不再溶解，析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察是否溶解。2乙醇沉淀蛋白质取蛋白质溶液1ml，加晶体NaCl少许，待溶解后再加入95%乙醇2ml混匀。观察有无沉淀析出。3重金属盐沉淀蛋白质取试管2支，各加蛋白质2ml，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内滴加1%CuSO4溶液，至有沉淀生成。倾去上清，向沉淀中加水，观察是否溶解。四、生物碱试剂沉淀蛋白质取2支试管

15、各加2ml蛋白质溶液及1%醋酸溶液4-5滴，向一管中加5%鞣酸溶液数滴，另一管内加饱和苦味酸溶液数滴，观察结果。实验注意事项1在双缩脲反应中，硫酸铜不能多加。2茚三酮反应需在pH5-7下进行。实验四 甲醛滴定法测定氨基氮初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。（一）原理氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：R-CH（NH3+）-COO R-CH（NH2）COO + H+-NH3+是弱酸，完全解离时pH为11-12或更高，若用碱滴定-NH3+释放的H+来测量氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示终点。常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促

16、使-NH3+释放H+，使溶液的酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内（pH9.0左右）。因此，可用酚酞作指示剂，用标准的氢氧化钠溶液滴定。（二）试剂11%酚酞酒精溶液：称1g酚酞溶于100ml 60%乙醇20.05%溴麝香草酚兰溶液：0.05g溴麝香草酚兰溶于100ml 20%乙醇溶液31%甘氨酸溶液4标准0.05N NaOH溶液：可用0.100N标准盐酸液标定5中性甲醛溶液：50ml甲醛，加入0.5%酚酞指示剂3ml，滴加0.1NNaOH使溶液呈微粉红色。（三）操作：取3个100ml锥形瓶，编号。向第1、2号瓶内各加入甘氨酸溶液（或样品）2ml和水5ml，混匀。向3号瓶内加入7ml水。然后向三

17、个瓶中各加入中性甲醛溶液5ml，0.05%溴麝香草酚兰溶液2滴及1%酚酞酒精溶液5滴，混匀后用0.05NNaOH溶液滴定至微红色。（四）计算氨基氮（mg/ml）=（VV0）× NNaOH ×14.008 / 2V：滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。V0：滴定对照液（3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。NNaOH：标准氢氧化钠溶液的真实当量浓度。实验五 双缩脲法测定蛋白质浓度实验目的及要求 了解并掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法。实验原理具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与铜离子形成紫色配合物，在540nm处有最大吸收。在一

18、定浓度的范围内，蛋白质和浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。实验仪器及用品实验器材：容量瓶、试管、吸管、722型（或7220型）分光光度计。实验试剂：1、双缩脲试剂：0.175g CuSO4·5H2O溶于约15 ml蒸馏水，置于100 ml容量瓶中，加入30 ml浓氨水，30 ml冰冷的蒸馏水和20 ml饱和NaOH溶液，摇匀，室温放置2h，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。2、牛血清白蛋白（1mg/ml）溶液3、未知浓度蛋白样品实验内容及步骤制作蛋白质标准曲线并测定样品中蛋白含量。 取10支大试管，编号，按下表操作。管号0123456样品样品样品标准牛血清蛋白溶液（

19、ml）00.30.60.91.21.51.8000待测液（ml）00000001.51.51.5蒸馏水（ml）3.02.72.42.11.81.51.21.51.51.5双缩脲试剂（ml）2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0充分混匀，即有紫色出现，用540nm光测定各管吸光度。根据标准溶液的吸光度，在坐标纸上绘制出浓度-吸光度曲线，测出未知液的吸光度后，在标准曲线上查出未知液的浓度。绘制浓度-吸光度曲线。 实验六 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质实验目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。实验原理醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。带

20、电物质在电场力作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。由于各种蛋白质都有特定的等电点，如将蛋白质置于pH值低于其等电点的溶液中，则蛋白质将带正电荷而向负极移动。反之，则向正极移动。因为蛋白质分子在电场中移动的速度与其带电量、分子的形状及大小有关，所以，可用电泳法将不同的蛋白质分离开来。血清中含有多种蛋白质，它们的等电点都在pH 7.5以下。将血清置于pH 8.6的缓冲液电泳时，所有的血清蛋白都带有负电荷，在电场中将向正极移动。由于各种血清蛋白在相同pH时所带电荷数量不等，分子颗粒大小不一，因而泳动速度不同，经电泳被分离开来。血清蛋白质的等电点和分子量见下表。蛋白质名称等电点（pI）相

21、对分子质量清蛋白4.8869 0001-球蛋白5.00200 0002-球蛋白5.06300 000-球蛋白5.129 000150 000-球蛋白6.857.50156 000300 000本实验以醋酸纤维素薄膜（简称CAM）为支持物分离血清中的不同蛋白质。它是一种良好的呈均一泡沫状疏松薄膜，厚约120m，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用量少，分离清晰，无吸附作用，应用范围广和快速简便等优点，目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白等方面。实验材料、仪器及试剂1材料：健康人血清或鸡血清。2仪器：电泳仪、电泳槽。3试剂：（1）醋酸纤维素薄膜（2×8cm）：市售成品（2

22、）pH8.6巴比妥缓冲液（离子强度0.060.07）：取巴比妥0.83克，巴比妥钠6.38克，加蒸馏水加热溶解后，定容至500ml。（3）染色液：取氨基黑10 B 0.5克，溶于50ml甲醇中，再加冰醋酸10ml，蒸馏水40ml混匀。（4）漂洗液：95%乙醇4.5ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml混合。（5）透明液：95%乙醇80ml，冰醋酸20ml混合。实验方法1浸泡：将醋酸纤维素膜条浸入巴比妥缓冲液中浸泡20min后取出，用吸水纸吸去多余缓冲液。2点样：仔细辩认薄膜的粗糙面与光滑面，将薄膜平铺在玻璃板上（粗糙面朝上），用玻棒蘸上血清样品，涂于盖玻片边缘处（边缘长度应比膜条宽度窄），再在膜条

23、一端2cm处接触，样品即呈一条状涂于薄膜上。待血清完全渗入薄膜后，将膜面翻转，点样面（粗糙面）朝下，置电泳槽中，薄膜点样端放于负极一侧。注意：样品应点在薄膜的粗糙面一侧。3电泳：打开电源，调节电压110130V，电流0.40.6 mA/cm宽，电泳时间4560分钟，电泳完毕后，关闭电源。4染色漂洗：将薄膜从电泳槽中取出，直接浸入染色液中约5分钟，再转入漂洗液中反复浸洗34次，直至背景颜色脱净为止。此时，正常血清蛋白在薄膜上显示出五条区带。从前端至点样处的方向分别为清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白及-球蛋白。5定量测定：将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别浸在体积0.4mol/L氢氧化钠溶液中，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，进行比色。或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡23分钟后，取出贴于洁净玻璃板上，干燥后，即为透明薄膜图谱，可用光密度计直接测定。注意事项1点样好坏是电泳图谱是否清晰的关键，点样量要适当。2漂洗时应多漂洗几次，直至无蛋白区底色脱净为止。实验七 氨基酸的纸层析实验目的及要求 了解并掌握氨基酸纸层析法的原理和方法。实验原理用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法。纸层析所用的展层