生物工程(绪论及基因工程)

1、绪论一、基本概念：1、 生物技术：利用生物有机体（包括微生物和动、植物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞、细胞器）和组织成分（包括DNA、RNA、蛋白质、酶、多糖、抗体等），形成新的技术手段来发展新产品和新工艺的一种技术体系。也是采用先进生物学和工程学技术，有目的、有计划定向加工制造生物产品的一个新兴技术领域。2、 生物芯片：是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中

2、靶分子的数量。由于常用硅片作为固相支持物，且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片技术。3、 基因治疗：就是将人正常基因或有治疗作用的基因通过一定的途径导入机体靶细胞以纠正基因缺陷或发挥治疗作用。4、 反义药物：又称为信息药物，是根据碱基互补原理，用人工合成或生物体内合成的载有特殊生物信息的药物分子和特殊核酸酶5、 干细胞工程：主要是从事干细胞及其相关产品的研发和产品中试工艺流程的设计。6、 组织工程学：也有人称其为“再生医学”，是指利用生物活性物质，通过体外培养或构建的方法，再造或者修复器官及组织的技术。2、 具体内容：1、 现代生物技术的主要内容有哪些，他们之间有什么相互关

3、系？生物技术的主要内容：1、 基因工程或蛋白质工程2、 细胞工程3、 酶工程4、 发酵工程四大工程之间的相互关系：1、 四大工程各成体系，相互独立，构成独立完整的体系1、发酵工程微生物单一菌种的各种纯培养2、酶工程酶制剂的生产利用及固定化和生物反应器3、细胞工程细胞（含器官和组织）的离体培养、繁殖、再生、融合，以及细胞核、细胞质、染色体与细胞器（线粒体、叶绿体）的移植与改造。4、基因工程核酸的分离提取、体外剪切、拼接重组、扩增与表达。2、各自的地位、作用与相互的关系：1、基因工程是核心起主导作用（头脑）2、细胞工程是主干起支撑作用（躯干）3、发酵工程是途经发展产业的基础（双腿）4、酶工程是工具

4、提高工业化水平、实现高效率、高自动化的工具（双手）2、生物技术的特点：1、不可取代性2、定向性特异性3、快速、精确4、高效、低耗基因工程：一、基本概念：1、基因工程：是指按照人们的意愿，在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之转入到原先没有这类分子的宿主细胞内，形成能持续稳定繁殖的新物种。其目的是为人类提供有用产品及服务。2、工具酶：凡在基因工程中应用的酶统称为工具酶3、限制与修饰现象：大多数的细菌对于噬菌体的感染都存在一些功能性障碍，即所谓的寄主控制的限制和修饰现象，简称R/M体系。4、限制酶：凡能识别并切割双螺旋DNA分子内特定核苷酸顺序的酶统称为限制酶。

5、5、同裂酶：识别顺序与切割方式均相同者，谓之同裂酶6、同尾酶：它是与同裂酶对应的一类限制酶，它们虽来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶。7、杂种位点：有一对同尾酶分别产生的粘性末端结合形成的位点，称之为“杂种位点”。必须指出，这类杂种位点的结构，一般是不能够在被原来任何一种同尾酶所识别和切割的。8、衔接物：是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸段片断。9、DNA接头：它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。10、基因工程载体：能将目的基因携带至宿主细胞

6、并可在其中自主复制的遗传因子11、细菌素：是一类特殊蛋白质，它通过同敏感细胞细胞壁的融合作用，而抑制一种或数种在细胞内进行的生命过程，如DNA复制、转录、翻译以及能量代谢等，从而使这些细胞停止生长。12、科斯质粒：是人工构建的，含有DNA 的粘性(cos)末端序列、质粒复制起始区及质粒一个抗药性标记的、兼具质粒与噬菌体DNA载体双重性质的特殊载体。13、科斯克隆：应用科斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA的技术14、安慰诱导物：IPTG是一种乳糖类似物，再无乳糖的条件下，他可以诱导细胞合成半乳糖苷酶。因此，IPTG被称为半乳糖苷酶的安慰诱导物15、基因组药物学：是研究对包括

7、药物在内的外界化学物质（有毒外源物）反应的遗传多样性。16、cDNA：是以mRNA为模版，用反转录酶合成互补DNA的方法。17、聚合酶链反应技术（PCR）：聚合酶链反应技术是指在四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸为引物，以单链DNA为模板，经DNA聚合酶催化，合成DNA互补链达到基因扩增目的的过程。 18、转化：自然的转化是指将携带某种遗传信息的DNA分子引入宿主细胞，通过同源重组作用。获得具有新遗传性状的生物细胞的过程。基因工程操作中的转化是泛指将重组DNA转入宿主中的方法。19、转染：自然界中，通过噬菌体或病毒的感染作用将一个细胞的遗传信息传递到另一个细胞的过程称为转染作用

8、。20、感受态细胞：能从其周围摄入DNA的细胞称为感受态细胞。21、原位杂交技术：根据核酸杂交原理，利用基因探针检出培养板上重组转化体菌落位置的技术称之为原位杂交技术。22、Southern印迹转移技术（Southern blot）：利用毛细管作用原理，将凝胶电泳分离后的DNA片段转移至硝酸纤维素膜上，并根据核酸杂交原理进行分析的技术称为Southern blot。23、蛋白质工程：蛋白质工程是指通过蛋白质化学、晶体学和动力学的研究，获取关于蛋白质物理、化学等各方面的信息，在此基础上，对编码该蛋白质的基因进行有目的的改造，并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终得到比天然蛋白质更好的产

9、物。24、拷贝数：拷贝数就是指某基因（可以是质粒）在某一生物的基因组中的个数. 单拷贝就是该基因在该生物基因组中只有一个,多则指有多个。25、标记营救：一株活性病毒和另一株相关但具有不同遗传标记的灭活病毒复合感染细胞，由于重组产生具有灭活病毒某些遗传标记的活性病毒重组体，灭活病毒的遗传标记因为重组而得到拯救，重新出现在有活力的重组体病毒中。这类病毒复活现象也可以称为交叉复活。 26、插入灭活效应：抗生素抗性基因必须完整，才能表达出有活性的酶去破坏抗生素而表现出抗药性，若把抗生素基因切断、分开或者改变，如在其中掺入一段外源基因，则抗性基因无法表达出有功能的酶而使抗生素失活，这种现象即为插入失活效

10、应。 二、具体内容：1、基因工程的内容和步骤。1)、获得目的基因2)、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能自我复制并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3)、将重组DNA分子转移到适当的宿主细胞中，并与之一起增殖。4)、从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得重组DNA分子的宿主细胞克隆。5)、从这些筛选出来的宿主细胞克隆中，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究用。6)、将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。2、 型限制性内切酶的基本特性和主要用途基本特性：1、识别位点为48个核苷酸序列 2、识别位点即为切割位

11、点 3、位点上的核苷酸序列通常呈双重旋转对称结构，即回文结构主要用途：1、在特异性位点上切割DNA，产生特异的限制酶片段 2、用限制酶切出的相同粘性末端，便于重组 3、改建质粒 4、建立DNA分子的限制酶图谱 5、构建基因文库3、 限制性内切酶的三种切割方式、在识别顺序两条对称轴上两侧同时从5端切断磷酸二酯键，形成5-磷酰基端25个核苷酸单链粘性末端。如EcoR 。、在识别顺序两条对称轴上两侧同时从3端切断磷酸二酯键，形成3-羟基端25个核苷酸单链粘性末端。、在识别顺序两条对称轴上同时切断磷酸二酯键，形成齐平末端或钝端4、DNA片段的连接方法，平端连接有哪些方法，各有什么特点？1、黏端连接：使

12、用DNA连接酶，T4DNA连接酶2、平末端DNA片段的连接的方法和特色 ·同聚物加尾法：利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)转移核苷酸的特殊功能，将同种核苷酸（dNTP)加到DNA分子单链延伸末端的3-OH上。如果在目的基因两侧加polydA，则在载体两侧加polydT。 特点：应用范围广，基本可以用于任何两端DNA分子间。但是插入的片段难以回收，且无法控制插入DNA片段的方向。 ·衔接物连接法（linker）：将衔接物的5末端和待克隆的DNA片段的5末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来，接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和载

13、体分子，由此使两者都产生出彼此互补的粘性末端。 特点：克隆后还可以回收原插入片段。 ·DNA接头法（adaptor）:当DNA接头的平末端与平末端的外源DNA片段连接后，便会使后者成为具有粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。 5、基因工程载体的必备条件 1、具有有效运载能力 2、携带外源性目的基因前后在宿主内功能自主复制 3、在宿主内能控制外源基因表达活动 4、鉴定方便，装卸手续简单 5、能携带大小不同的外源性目的基因、载体分子量要小,载力要大 6、容易控制、安全可靠、稳定性好 6、常用的克隆载体 1、质粒载体：Col E1质粒载体，pSC101质粒载体：第一个真核在原核中表达

14、的质粒载体pBR322质粒载体：人工构建的载体pUC质粒载体：在pBR322载体质粒的基础上，组入了一个在其5端带有一段多克隆位点的lacZ基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。2、噬菌体载体：噬菌体DNA；（凯伦噬菌体）柯斯载体cosmid；单链DNA噬菌体载体（M13） 3、真核基因病毒载体：SV40病毒载体；昆虫杆状病毒载体 真核病毒载体的优点 1、 有很高的拷贝数； 2、 强大的启动子，可保证外源基因的高效表达； 3、 可保证糖基化。7、基因获得的方法有哪些？各有哪些特点？ 1、基因分离的物理方法：获得的是GC片段，AT片段在获得过程中变性缺失。2、鸟枪法： 优点：操作

15、简单，命中率较高。 缺点：盲目性大，阳性片段不一定正好是基因，样本多，可能会遗漏掉基因。 3、cDNA文库的建立与基因的分离 局限性：并非所有的mRNA分子都具有polyA结构； 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 ；mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难 ； 仅限于克隆蛋白质编码基因,没有内含子，不能用于真核表达。 4、基因组文库法： 从基因组文库所分离获得的基因序列包含有内含子，因此不能直接在原核细胞中表达，但更适合作为如转基因动物等的真核表达系统。 5、基因的化学合成 基因的化学合成的优点：、可以合成细菌偏爱的密码子、可以定向改变个别氨基酸 、可以在两端加上需要的限制酶切

16、点 、可以通过自动化仪器合成 6、聚合酶链反应技术（PCR） 1、操作简单 2、通用性好 3、成功率高8、cDNA文库的建立有哪些步骤? 1、分离表达目的基因的组织或细胞。 2、从组织和细胞中制备总RNA和mRNA 3、第一条cDNA链的合成 4、第二条cDNA链的合成 5、cDNA上接头的加入 6、双链cDNA与载体的连接 7、从众多的重组体中筛选出特定的基因 9、PCR主要步骤 PCR技术反应周期包括三个步骤： 1、高温变性：通过加热使得复制双螺旋DNA变性分 离为单链，作为模板。（>91，1分钟）。 2、低温退火：（约50，1分钟）使专门设计的一 对寡核苷酸引物在此低温条件下分别与

17、单链模 板DNA两端的互补区段互补结合。 3、适温延伸：将反应混合物的温度上升到72，保温1分钟。10、常用的将重组DNA转入宿主细胞的方法 一、CaCl2处理后的细菌转化与转染二、高压电穿孔法三、聚乙二醇介导的原生质体转化：本方法适用于转化酵母细胞以及其他真菌细胞四、磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染：将外源基因导入哺乳类细胞中进行瞬时表达的常规方法。五、原生质体融合六、脂质体法七、细胞核的显微注射法：此法多用于转基因动物。八、激光打孔技术九、基因枪法：可用于：动物细胞、真菌、植物细胞。11、外源基因在宿主细胞高效表达的关键问题及其解决方案 （一）、有效的转录起始与基因的高效表达 关键：选择

18、强的可调控的启动子。 理想状况是：在发酵的早期阶段，表达载体的启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而引起细胞死亡等问题。当细胞生长到一定的密度，通过各种诱导（如温度、药物等)使阻遏物失活，快速启动转录。 原核细胞中这类启动子有：Lac、Trp、PL、PR等。 （二）、mRNA的稳定性与基因高效表达 措施： 1、利用RNase缺失的受体菌 2、mRNA的5端与3端的正确加工，提高mRNA的稳定性 （三）、有效地翻译起始与基因的高效表达 1、首选AUG为起始密码子； 2、正确的SD序列； 3、SD序列与起始密码子之间的距离以9±3为宜； 4、除S

19、D序列外，处于起始密码5端的核苷酸应为A和U； 5、如果在起始密码AUG后的序列是GCAU或AAAA，能使翻译效率提高； 6、在翻译起始区周围的序列应不形成明显的二级结构。 （四）、遗传密码应用的偏倚性与基因高效表达 真核细胞与原核细胞对遗传密码的偏倚性不同，在不同表达系统中，使用偏倚性密码，尤其对于基因编码序列的5端使用偏倚性密码，能有效提高表达效率。 （五）、 mRNA的加工与基因高效表达 绝大多数较高等的真核基因含有内含子，这些内含子在mRNA的加工过程中，在细胞核中被加工去除而产生成熟的mRNA。但许多哺乳动物类细胞中外源基因的表达需要内含子存在，如果在转基因动物中表达外源基因时，最好

20、用基因组基因而非cDNA。 （六）、 mRNA序列上终止密码的选择 1、首选UAA 2、用一串连的终止密码，而不是只是一个终止密码，以保证翻译有效终止。 （七）、表达质粒拷贝数及稳定性与基因高效表达 一般来讲：质粒拷贝数多，基因表达水平高；质粒稳定性高，表达好。 （八）、外源蛋白的稳定性与基因高效表达 1、通过组建融合基因，产生融合蛋白； 2、产生可分泌的蛋白质； 3、以包含体的形式表达； 4、选择合适的宿主表达系统。 12、假如用大肠杆菌生产人的-珠蛋白，必须经过几个基本步骤 、获得人产-珠蛋白的基因 、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能自我复制并具有选择记号的质粒上，形成重组DNA分子。 、将重组DNA分子转移到大肠杆菌中，并与之一起增殖。 、从大肠杆菌繁殖菌落中，筛选出获得重组DNA分子的宿主细胞克隆，此处即为大肠杆菌。 、从这些筛选出来的大肠杆菌中，提取出已经得到扩增的目