实验七 用温度敏感型启动子表达系统表达目的基因

1、实验七 用温度敏感型启动子表达系统表达目的基因实验目的 1. 掌握将目的基因插入表达载体中表达目的蛋白的技术路线和试验流程。 2. 了解通过诱导重组DNA表达目的基因的技术。实验原理 PLPR启动子是大肠杆菌l噬菌体中控制早期转录的启动子，具有极强的起始RNA转录的功能，基因工程中常用它来构建高效表达载体，它受抑制物CI蛋白的负调控。在实际中CI蛋白被改造成温度敏感型(CIts)，由DNA片段CIts857（857bp长）编码。CIts在30时具有抑制启动子的活性，在42时失活而失去抑制启动子的活性，因此，改变工程菌的培养温度即可控制目的基因的表达，这一点比用诱导剂诱导表达的系统要节省操作步骤

2、和成本，在大规模基因表达中优点尤其明显。有些表达载体本身带有CIts857片段，能自身编码CIts蛋白，对宿主的选择范围较宽；另一些表达载体自身不带CIts857片段，选择宿主茵时，要求宿主是有缺陷的原噬菌体溶源化的菌株（如M5219)，前一类载体表达效率往往更高。 将IL基因以5'端EcoRI和3'端BamHI酶切位点插入pBV220载体多克隆位点中，转化到大肠杆菌JMl03内，便能通过温度的变换控制CI蛋白的活性，继而调节启动子的活性，使IL基因连同其5'端上游带SD序列转录成mRNA并转录终止于rrnB位点，SD序列与ATG的间距为6bp，mRNA作为模板使核糖体

3、高效翻译出IL产物。实验材料和试剂 （一）实验材料 1载体：pBV220为中国预防医学科学院病毒学研究所构建。 2质粒pUCl8-IL。 3大肠杆菌JMl03。 （二）培养基 lLB液体培荞基，LB固体培养基（同实验一）。 2加氨苄青霉素（Amp）的LB固体培荞基（同实验一）。 （三）试剂 1酶类：EcoRI、BamHI、T4DNA连接酶。 2DNA回收试剂盒。（四）仪器 PCR自动扩增仪 微量移液器 离心机 电泳仪水平电泳槽 透射紫外观察仪 实验步骤 1用EcoRI和BamHI酶切pBV220（1mg）（酶切方法见实验四），pBV220经纯化后待用。 2用EcoRI和BamHI酶切pUCl8

4、-IL DNA（4mg），酶切好的600bp IL DNA片段用DNA回收试剂盒回收待用。 3取0.2mg酶切好的pBV220载体加0.2mg 的600bp IL DNA片段，用T4DNA连接酶连接（见实验五）。 4取连接产物转化JMl03感受态菌，涂布于加Amp的LB固体培养基上。 5快速抽提质粒；酶切鉴定重组质粒。 6用接种环取重组克隆于3ml 含50 mg/ml Amp的LB液体培养基的150×15mm试管中，斜置于30恒温摇床，200r/min培养过夜。 7次日上午取过夜培养菌30ml接种于3ml含50 mg/ml Amp的LB液体培养基的150×15mm试管内，分

5、别接种6管。斜置于30恒温摇床，200r/min培养约3小时。 8当细菌浓度生长到OD550 = 0.51.0时，取出5管移入42恒温培养摇床内，200r/min诱导表达，余下1管为不诱导表达的对照样品。 9以1小时的间隔依次取出1管并做好标记，置于冰中待用。 10诱导完毕后，将样品摇匀，各取1ml分别加入Eppendorf管中，10,000r/min离心5分钟，上清液用微量移液器轻轻吸去，再于离心机中10,000r/min离心5分钟，再吸去残留上清液。 11将Eppendorf管在涡旋混旋器上振荡，使沉淀散开至不见块状物。 12各管中加入SDS-PAGE电泳上样液50ml振荡混匀，置于100

6、水中，煮5分钟，取出于离心机中10,000r/min离心10分钟。 13各管分别取1520ml于12% SDS-PAGE中电泳，40V过夜。 14将胶剥下于考马氏亮蓝染色液中染色5小时以上。 15胶于脱色液中脱色至透明。 16结果分析，SDS-PAGE电泳分析结果，不经诱导的细菌没有特定位置的条带，诱导后的细菌随时间的不同表达的蛋白量不同，诱导4小时后基因的表达趋于稳定，最高表达量约为30%。【提示】 1表达菌株的过夜培养物接种，是为了在诱导表达时培养基中的细茵能尽量处于同步生长状态，以便于产物的大量表达。在安排实验时，前一天应考虑到将过夜菌接种培养。该实验的时间较长，第一次操作时，时间安排不

7、当，当天可能做不完，而表达产物又不适合于过夜放置，应当予以注意。 2一般在大肠杆菌高效表达真核基因时，所产生的产物常以包含体的形式存在，用超声仪破裂细菌后进行离心，表达产物存在于离心管底，而不在上清液内，因此当上清液内分析不到样品时，应考虑分析离心沉淀物，最好是第一次分析所表达的产物时，将两者同时进行电泳分析，以确定表达产物在宿主菌内的存在形式。 3原核表达系统表达基因，其产物在宿主中的存在形式并不是固定不变的，随培荞基的营养状况、诱导培养的时间和表达效果的高低而不同。包含体产物一般不能直接用于常规层析方法进行纯化，必须用盐酸胍等非离子型强变性剂溶解，并用不同的方法将产物复性后才能进行常规分高

8、纯化，否则会给后期实验带来不便。如果能将表达产物变成可溶性形式，将有利于后续实验的快速开展。表达菌培养时、营养状况好、诱导表达时间短、表达效率降低都有利于可溶性表达产物的形成。 4宿主菌都有其自身的蛋白质，表达的产物在SDS-PAGE电泳时，其分子量可能会与宿主菌的蛋白质条带重叠，给分析结果带来麻烦。近到这种情况，一般采用以下几种办法来处理：比较表达结果与对照结果中各条蛋白带的浓度，并选择几条肉眼看到浓度无差别的蛋白带为比较对照，寻找表达结果中是否有浓度增加的蛋白条带。如果有，则可进一步分析；改变电泳胶的浓度（调整电泳胶的有效分辨范围），使蛋白重叠条带分开；用抗血清或抗体对SDS-PAGE做免

9、疫WesternBlot（免疫印迹实验），观察表达结果中是否有特异性条带出现。 5表达产物观察不到时，很可能是目的基因与载体上启动子匹配不好。mRNA转录出来后，如果在SD序列或目的基因的ATG位点及附近出现有二级折叠结构，并且其茎环中茎的长度大于5bp时，会严重影响到蛋白质的翻译效率，产率极低。通过定点突变或更换载体使这类二级结构消除，可使表达效率提高10100倍以上。 【附录】 SDS-聚丙烯胺凝胶的制备方法 （一）试剂1. 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺 29 g N，N-亚甲双丙烯酰胺 1 g 蒸馏水 100 ml 加热至50搅拌溶解，于4保存。210%SDS：蒸馏水配制，室温保存。310%

10、过硫酸铵：蒸馏水配制，4保存，一周内使用。4TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺）51.5mol/L Tris-HCl（pH8.8）和1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）6电泳缓冲液 25 mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 250 mmol/L 甘氨酸 0.1% SDS 7电泳加样缓冲液 50 mmol/L Tris-HCl（pH6.8） 50 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT） 2 % SDS 1 % 溴酚蓝 10 % 甘油 （二）操作 1将玻璃板和垫片依次用5%的KOH甲醇溶液、去污剂和清水洗涤，晾干。将无凹口的玻璃板平放在桌面上；将垫片两面涂少许凡士林后，排放

11、在玻璃两侧，再将有凹口的玻璃板在垫片上放置妥当。将玻璃夹层推至桌沿，用胶带纸封闭三个侧面，留出有凹口的一面不封闭。 2使玻璃夹层竖立，有凹口面朝上。根据所需的凝胶浓度和用量，按表7-1的比例配制分离胶溶液 3一旦加入TEMED，混匀后立即小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，为积层胶留有足够空间。用吸管轻轻在其顶层加入几毫升异丁醇，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。 4聚合完成后（约3060分钟）后，倒掉覆盖液体，用蒸馏水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干凝胶顶端的残余液体 5根据所需用量，按表7-2的比例配制积层胶溶液。6注入积层胶溶液，插入梳子，小心避免气泡，垂直放置于室温下。7在积

12、层胶聚合完成（约30分钟）后，小心拔掉梳子。用蒸馏水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺。8将凝胶放入电泳槽中，上下槽均加入1×电泳缓冲液，检查是否泄漏。驱除两玻璃板之间凝胶底部的气泡，即可上样。表7-1 配制SDS-PAGE凝胶电泳分离胶浓度与所用溶液量溶液成分550ml凝胶溶液中各成分所需体积（ml）1015202530405012%凝胶溶液H2030%丙烯酰胺1.5mol/L Tris-HCl (pH8.8)10%SDS10%过硫酸胺TEMED15%凝胶溶液H2030%丙烯酰胺1.5mol/L Tris-HCl (pH8.8)10%SDS10%过硫酸胺TEMED3.34.02.5 0

13、.1 0.1 0.0042.35.02.50.10.1 0.0044.96.03.8 0.15 0.15 0.006 3.47.53.8 0.15 0.15 0.0066.68.05.0 0.2 0.2 0.0084.6 10.05.00.20.2 0.0088.2 10.06.3 0.25 0.25 0.0105.7 12.56.3 0.25 0.25 0.0109.9 12.07.5 0.3 0.3 0.0126.9 15.07.50.30.3 0.012 13.2 16.0 10.0 0.4 0.4 0.0169.2 20.0 10.00.40.4 0.016 16.5 20.0 12.5 0.5 0.5 0.020 11.5 25.0 12.50.50.5 0.020表7-2 配制SDS-PAGE凝胶电泳积层胶所用溶液量溶液成分110ml凝胶溶液中各成分所需体积（ml）12456810H2030%丙烯酰胺1.0mol/L Tris-HCl