多发性硬化患者IFN-γ及IL220分泌性T细胞的变化.

1、多发性硬化患者IFN- Y及IL220分泌性T细胞的变化摘要： 目的通过计数促炎症性细胞因子 IFN-Y 及抗炎症性细胞因子 IL-10 分 泌性T细胞数目，观察多发性硬化(MS患者此两类细胞因子(CK的变化。 方法采用酶联免疫斑点(Elis pot )技术检测MS患者、其他神经疾病(OND患 者及正常对照组(NC外周血(PB及脑脊液(CSF中MBF及其他抗原反应性 IFN- 丫和IL-10分泌性T细胞数目，并对活动期与缓解期 MSS甲基强的松龙 (MP)冲击疗法前后MS患者PB中两种CK分泌性T细胞数目进行了比较。结果活 动期MS患者PB及CSF中IFN- 丫及IL-10分泌性T细胞数目较O

2、ND及 NC组明 显增多(P v 0.05) , CSF中MBP反应性T细胞差异更为显著(P v 0.01)。MS患者 PB中IL-10分泌性T细胞数在缓解期较活动期明显升高(P v 0.05) 0 MP台疗后 IFN- 丫分泌性T细胞数目明显减少，而IL-10分泌细胞数目明显增多(Pv 0.01) 0结论在MS发病机制中IFN- 丫起促进作用，而IL-10有保护作用，是 促、抗炎症性CK的比值而非按顺序的表达决定 MS的活动性。MP疗法的部分机 制可能是调节CK网络的平衡。关键词： 多发性硬化；脑脊液；丫 -干扰素；白细胞介素-10； T细胞中图分类号： R744.5+1文献标识码： A文章

3、编号： 1006-29632000)03-146-06The Cha nges of IFN- 丫and IL -10 Secreting T Cellsin Multiple Sclerosis PatientsABSTHAC：T ObjectiveTo investigate the changes of cytokines(CK) in multiple sclerosis (MS) by counting the numbers of pro-inflammatoryCK IFN- 丫 and anti -inflammatory CK IL-10 secreting T cells.

4、 MethodBy reverse Elispot assay,the numbers of the two CK secreting cells stimulated by different antigen in PB and CSF of MS,and other neurological diseases (OND) as well as normal controls (NC) were detected.We also compared the difference of numbers of two subsets of secreting T cell,between the

5、exacerbation and remission stage,before and after methylprednisolone (MP) therapy. ResultsMS patients in the exacerbation stage had more IFN- 丫 and IL -10 secreting T cells in both PB and CSF than OND or NC grou p(P v 0.05),es pecially whe n stimulated by MBP and in CSF( Pv 0.01).ln MS remissio n st

6、age more IL-10 secreting T cells were found(P v0.05).After MP therapy the number of IFN- 丫 secreting T cells decreased greatly while IL-10 sec-retingT cells in creased( Pv 0.01). Con clusio nIFN-丫 is a disease -p romoti ngCK while IL- 10 is a protective CK in MS,it s the ratio between pro and anti-i

7、nflammatory CK that determine the clinical phenomena.The mechanism of MP therapy may be partly due to the balancing effect on the CK network.Key words ： multiple sclerosis ； cerebrospinal fluid ； interferon- Y； interleukin-10； T cells多发性硬化（MS）的发病机制迄今未明，其病理学特征是其脱髓鞘病灶多分布于 小静脉周围，有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润，促炎症性细胞因子

8、 （CK） 和抗炎 症性CK的平衡在维持机体正常免疫功能中起重要作用。我们采用酶联免疫斑点 （Elispot）技术，从单细胞水平检测了 MS患者丫 -干扰素（IFN- 丫）和白细胞介 素-10 （IL-10）分泌性T细胞水平，并观察了甲基强的松龙（MP）冲击疗法的作用。1 材料和方法1.1 检测对象1.1.1MS 组：共 15 例，按 Poser 诊断标准，临床或实验室支持确诊 12 例，临 床可能 3 例。男 5 例，女 10 例，年龄 1660 岁，平均 35 岁。其中 12 例接受 甲基强的松龙冲击疗法， 1.0 g/d ，连续 4 d ，静脉滴注。 15 例患者入院时皆处 于活动期，经

9、治疗出院时 10 例病情缓解。患者均于入院后及出院前取双份外周 静脉血。接受甲基强的松龙治疗者于治疗开始及治疗 4 d 后取外周静脉血，每 次取5 mL。11例患者于入院后行常规腰穿，每次采集 CSF 8 mL。1.1.2其他神经疾病（OND组：共15例（男7例，女8例），年龄2065岁， 平均 54 岁。脑梗死 7 例，脑囊虫症 3 例，癔病 2 例，血管神经性头痛 2 例，帕 金森病1例。患者入院后取静脉血5 mL;除脑梗死患者外的8例OND患者每例 采集 CSF 8 mL。1.1.3正常对照（NC）组：在15例健康成人采集外周血（PB）（男6例，女9 例），年龄 16 60 岁，平均 4

10、0 岁。 8 例无神经系统病变的手术腰麻者（男 4 例和女4例，年龄3462岁，平均45岁）采集CSF所有受检者于留取标本6 个月内均未使用过激素或免疫抑制剂。1.2PB及CSF勺单个核细胞（MNC分离采静脉血510 mL加等量1640培养液 （GIBCOBRL Co.US置肝素化硅化玻璃试管中混匀，经用淋巴细胞分层液进行密 度梯度离心，分离PB-MNC再用1640液洗涤离心3次，用加有2 mmol L谷氨 酰胺、1%（体积分数）MEM抗生素、20%体积分数）胎牛血清（FCS）的 1640细 胞完全培养液重悬，调整 PB-MNC田胞数到1X106个/mL。常规腰穿取CSF 8 mL 200 g

11、，离心10 min，分离的MNC!以1640洗1次，用1640完全培养液 调整CSF-MN细胞数至（510） X 104个/mL。1.3抗原制备MBPI牛脑髓鞘素中提取，经用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS-PAGE纯化，在相对分子质量240 000处显示单一条带。根据 Lindstrom 等方法，从加利福尼亚电鳗的电器官 (Pacific Bio-Marine,CA,US) 中提取及纯化 AChR。1.4抗原特异性T细胞的检测采用ELIS POT技术1检测IFN- 丫及IL-10分 泌细胞(瑞典MABTECHAB司试剂盒)。在硝酸纤维膜微量板上包被小鼠抗人 IFN- 丫 mAb(

12、1-D1k)或小鼠抗人 IL-10 mAb(7-D7)，浓度为 10 mg/L，100 卩L/孔，4C过夜。每孔加入200 Z的细胞悬液，分别加入终浓度为10 mg/L MBP 5 mg/L AChR，并设不加抗原的空白对照，以“ 0Ag表示，置37C， 5%体积分数)CO2孵箱中孵育48 h。加入浓度为2 mg/L的生物素化小鼠抗人 IFN- 丫 mAb(7-B6-1-Biotin) 或生物素化兔抗人 IL-10 mAb(12G8-Biotin) ，100 卩L/孔，室温孵育2 h。加入1 : 1000稀释的亲合素-生物素-碱性磷酸酶复合 物，100卩L/孔，室温孵育1 h 0配制底物(Tr

13、is 1 mL+NBT 4.4 卩L+BCIP 3.3卩L),每孔加入100卩L,避光显色1520 min，显示紫色斑点，用流水 洗板终止反应。将板置于室温下干燥，由不知受检对象的专人在解剖显微镜下 计数斑点数，已证明该方法检测的斑点即代表特异性CK分泌细胞2o结果表示为IFN- 丫或IL-10分泌细胞数/105 MNCo因本组数据呈非正态分布，采用 Mann-Whitney U-test ，配对数据比较采用符号等级 Wilcoxon 检验02结果 2.1活动期MS的IFN- 丫分泌性T细胞活动期MS患者PB中MBPS应性IFN- 丫 分泌细胞数较OND NC组明显增多，差异有显著意义(P &

14、lt; 0.05);但AChR及 0Ag反应性IFN- 丫分泌细胞，与OND NC组分别相比，差异无显著意义(P > 0.05) 0 CSF中 MBPS应性IFN- 丫分泌细胞数较OND NC组明显增多，差异有 极显著意义(P< 0.01) 0 CSF中自发性IFN- 丫分泌细胞数较OND NC组也明显 增多，差异有显著意义(P < 0.05) 0 CSF中的MBPS应性IFN- 丫分泌细胞数约 为PB的30倍；而CSF的自发性IFN- 丫分泌细胞数约为PB的15倍(表1) o表1活动期MS OND NC组PB及CSF中IFN- 丫分泌性T细胞数Table 仃he numbe

15、r of IFN- 丫 secreting T cells in PB and CS F of active MS,OND and NC(number of secreting T cells/105MNC )(±s)Group PB CSF n MBP AChR 0Ag n MBP 0AgActiveMS 15 6.5 ±7.8（2 51） 3.9 土 3.1 （0 20） 4.2 土 3.8 （0 24） 11 209 ± 170 （20 460） 76 ± 54 （10 200）OND 15 4.1 ± 4.3 （0.5 28） 4.7

16、± 5.1 （2 29） 5.4 ± 3.0 （1 30） 8 60 ± 28 （15 125） 51 ± 42 （10 110）NC 15 3.4 ± 4.6 （1 24） 3.6 ± 3.4 （0 20） 3.0 ± 4.1 （0 18） 8 54 ± 73 （0 275） 62 ± 35（0 140）P* < 0.05< 0.05> 0.05> 0.05> 0.05> 0.05< 0.01< 0.01< 0.05< 0.05；the sec

17、ond* The first line: active MS group compared with OND group line: active MS group compared with NC group 2.2活动期MS的IL-10分泌性T细胞活动期MS患者PB中MBP反应性IL-10分 泌细胞数较OND NC组明显增多，差异有显著意义（P皆V 0.05）;但AChR及 0Ag反应性IL-10分泌细胞，与OND NC组分别相比，差异无显著意义（P皆0.05）。CSF中 MBP反应性IL-10分泌细胞数较OND NC组明显增多，差异有极 显著意义（P皆V 0.01）。CSF中自发性IL-

18、10分泌细胞数较OND NC组也明显增 多，差异有显著意义（P皆V 0.05）。CSF中MBP反应性IL-10分泌细胞数约为PB的15倍,较IFN- 丫的CSF/PB比值明显为低；CSF的自发性IL-10分泌细胞 数约为PB的10余倍（表2）。表2活动期MS OND NC组PB及CSF中IL-10分泌性T细胞数Table 2The number of IL-10 secreting T cells in PB and CSF of activeMS,OND and NC （number of secreting T cells/105MNC ）（±s）Group PB CSF n M

19、BP AChR 0Ag n MBP 0AgActiveMS 15 7.1 ±2.8（2 16） 4.0 土 2.1 （0 11） 3.8 土 3.1 （0 10） 11 110 ± 76 （10265） 36±28 （0 80）OND 15 4.7±3.4 （1 16） 4.1 ± 3.8 （0 17） 4.4 ± 2.5（1 13） 8 40 土 19 （0 75） 31 土 21 （0 60）NC 15 5.3 ± 4.2 （1 12） 3.6 ± 4.1 （1 16） 4.0 ± 3.4 （2 15

20、） 8 32 ± 21 （0 70） 24 ± 17 （0 50）P* < 0.05< 0.05> 0.05> 0.05> 0.05> 0.05< 0.01< 0.01< 0.05< 0.05 * The first line: active MS group compared with OND group,the second line: active MS group compared with NC group 2.3活动期与缓解期MS外周血IFN- 丫、IL-10分泌性T细胞数变化自发性及 MBPS应性IL

21、-10分泌细胞数在缓解期较活动期皆明显增多，差异有显著意义（P皆 0.01 ）,而自发性及MBPS应性IFN- 丫分泌细胞数在活动期与缓解期 差异无显著意义（卩皆0.05 ）（表3）。表3活动期及缓解期PB中IFN- 丫及IL-10分泌性T细胞数Table 3The number of IFN- 丫 and IL -10 secreting T cells in PB in MS exacerbation and remission stage （number of secreting T cells/105MNC （ ± s）Group n IFN- 丫 IL -10MBP 0Ag

22、 MBP 0AgMS in exacerbationstage 15 6.5±7.8（0 51） 4.2±3.8（0 24） 7.1±2.8（2 16） 3.8±3.1（0 60）MS in remission stage 10 5.8 ±4.3（0 48） 4.5 ±3.1（0 30） 13.4 ±5.8（2 34） 8.0 ±5.7（3 29）P > 0.05 > 0.05 < 0.01 < 0.01 2.4MP冲击疗法对MS患者外周血IFN- 丫、IL-10分泌性T细胞数的影响MP治

23、疗后与治疗前比较，PB中自发性及MBP反应性IFN- 丫分泌细胞数明显减少， 而自发性及MBPS应性IL-10分泌细胞数较治疗前明显增多，差异有极显著意 义(P 皆 0.01)(表 4)。表4MS组MP疗法前后PB中IFN- 丫及IL-10分泌性T细胞数Table 4The number of IFN- 丫 and IL -10 secreting T cells in PB before and after MP therapy（number of secreting T cells/105MNC）（ ± s）Group n IFN- 丫 IL -10MBP 0Ag MBP 0Ag

24、Before MPtherapy 12 6.7 ±7.4（2 51） 4.0±3.4（0 23） 6.8±3.0（2 16） 3.9±2.6（0 10）After MP therapy 12 3.4 ±3.1（0 19） 2. 3±2.0 （0 12） 11.2 ±8.7（1 30） 7.0 ±4.3（2 25）P V 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 3 讨论 本研究结果显示，MS患者在MBP乍用下，PB及CSF中分泌IFN- 丫及IL-10的 T细胞数明显增多，但 MS患者A

25、ChF分泌性T细胞水平较低，提示其 MBP反应 性T细胞应答是一种特异性反应。MS患者CSF中 MBP反应性CK分泌T细胞数 远高于PB（IFN- Y为30倍，IL-10为15倍），可能因CSF更邻近于免疫攻击的 靶器官 CNS。本结果表明，活动期 MS患者PB（用MBP刺激）、CSF（无及有MBP刺激）IFN- 丫分 泌性T细胞数目较ON及NC组明显增多，国外以PCF法研究示MS患者PB及 CSF内IFN- 丫 mRNA表达明显增加3。在复发EAE动物中，CNS内 IFN- 丫含 量升高，而以抗IFN- 丫抗体预先注入可防止EAE的被动免疫发生。Horwitz等CK如 IL-1、4在表达小鼠

26、IFN- 丫 cDNA的转基因鼠发现有原发性脱髓鞘病损，并表现出 EAE的临床特点，这直接提示了 IFN- 丫是CNg脱髓鞘的诱导者，说明IFN- 丫 是MS及EAE关键的致病因子，IFN- 丫升高可诱导及促使MS病情进展。这可能 由于IFN- 丫可激活巨噬细胞释放髓鞘毒素，激活其他促炎症性TNF-a等，可以上调MHCB类分子在胶质细胞表面的表达，并可诱导少突胶质 细胞凋亡 5等。活动期MS患者PB（用 MBP刺激）及CSF（无及有MBP刺激）中IL-10分泌性T细胞 数较OND及NC组皆明显增多，且在 MS病程中缓解期较活动期PB中IL-10分泌 性T细胞明显增多。Navikas 6等报道M

27、S患者MN® IL-10 mRNA表达增 高，且在缓解期更高。在免疫动物前给予IL-10可防止EAE发生，均提示IL-10 在MS的免疫病理过程中起保护作用，IL-10水平升高可能导致MS的缓解。 有可能由于IL-10可抑制抗原递呈细胞的功能，下调 MHCfl类抗原的表达，可 抑制Th1细胞的增殖及其CK的合成7;可下调ICAM-1的mRN表达水平， 使T细胞活化必需的协同刺激分子 CD80 CD86等水平下调；还可通过减少一氧 化氮的产生而抑制活化的巨噬细胞的细胞毒作用，从而减轻对髓鞘的破坏 8。值得注意的是，活动期 MS患者PB及CSF中促、抗炎症性CK IFN- 丫和IL-10

28、 分泌性T细胞数均明显升高，但活动期 MS的CSF与 PB中IFN- 丫分泌性T细胞 数目的比值（30倍）比IL-10（15倍）的明显为高。可能因为 MS急性发作时同时 启动了 Th1、Th2型免疫反应，是促、抗炎症性 CK的相对水平而非按顺序的表 达决定疾病的活动度。本组MP台疗后与治疗前比较，PB IFN- 丫分泌性T细胞数明显减少，IL-10分 泌性T细胞数明显增多。这提示 MP疗法的部分机制可能与下调IFN- 丫和上调 IL-10等两类CK网络的平衡有关。参考文献 :1Czerkinsky C,Andersson G,Eken HP,et al. Reverse ELISPOT ass

29、ay for clonal analysis of cytokine production.I.Enumeration of gammainterferon secreting cellsJ. J Immunol Methods, 1988,110: 32-36. 2 Olsson T,Wang WZ,Hojeberg B,et al. Autoreactive T lymphocytes in multiple sclerosis determined by antigen-induced secretion ofin terfero n-丫 J . J Clin In vest, 1990,86: 981-986.3 Link J,Sod