第3章DNA的复制

1、第三章第三章 DNA的复制的复制 本章重点介绍遗传中心法则和本章重点介绍遗传中心法则和DNA的半的半保留复制以及逆转录的过程和机理，对保留复制以及逆转录的过程和机理，对DNA的损伤和修复、突变和重组作一般介绍。的损伤和修复、突变和重组作一般介绍。 思考思考 DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年年Watson & Crick提出提出DNA双螺旋结构模型双螺旋结构模型后，后，1958年，年，Crick提出了提出了“中心法则中心法则”(Central dogma)揭示了遗传信息的传递规律。揭示了遗传信息的传递规律。楚雄师范学院化学与生命科学系楚

2、雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国遗传信息传递的遗传信息传递的 中心法则中心法则蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆转录逆转录复制复制复制复制DNARNA生物的遗传信息以密码的形式储生物的遗传信息以密码的形式储存在存在DNA分子上，表现为特定的核苷分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给传信息通过转录传递给RNA，再由，再由RNA通过翻译转

3、变成相应的蛋白质多通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的病毒能以自己的RNA为模板复制出新为模板复制出新的病毒的病毒RNA，还有一些，还有一些RNA病毒能以病毒能以其其RNA为模板合成为模板合成DNA，称为逆转录，称为逆转录这是中心法则的补充。这是中心法则的补充。 中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人中心法

4、则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。目目 录录第一节第一节 DNA DNA生物合成生物合成第二节第二节 DNA DNA的损伤与修复的损伤与修复第三节第三节 DNA DNA突变突变 第四节第四节 DNA DNA的遗传重组的遗传重组楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范

5、树国范树国DNA体内复制：原核、真核生物的染色体、细菌质体内复制：原核、真核生物的染色体、细菌质粒（环状，双链）、真核细胞器粒（环状，双链）、真核细胞器DNA（线粒体、叶（线粒体、叶绿体）、病毒（双链，环状）绿体）、病毒（双链，环状）DNA的体外复制：分子克隆。的体外复制：分子克隆。 DNA生物合成有两种方式生物合成有两种方式1. DNA的复制（的复制（DNA指导下的指导下的DNA合成）合成）2. 逆转录作用（逆转录作用（RNA指导下的指导下的DNA的合成）的合成）楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国DNA的复制的复制一一、概念和实验依据概念和实验依据二二、D

6、NA聚合反应有关的酶类聚合反应有关的酶类三、三、DNA的复制的起始点和方式的复制的起始点和方式四、原核细胞四、原核细胞DNA的复制过程的复制过程五、五、DNA复制的忠实性复制的忠实性六、真核细胞六、真核细胞DNA的复制的复制 DNA在复制时，两在复制时，两条链解开分别作为模板，条链解开分别作为模板，在在DNA聚合酶的催化下按聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以与模板链互补的新链，以组成新的组成新的DNA分子。这样分子。这样新形成的两个新形成的两个DNA分子与分子与亲代亲代DNA分子的碱基顺序分子的碱基顺序完全一样。由于子代完全一样。由于子代DNA分

7、子中一条链来自亲代，分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复种复制方式称为半保留复制制(semiconservative replication) 。DNA的的半保留复制半保留复制的概念的概念DNA的半保留复制可以说明的半保留复制可以说明DNA在代谢上在代谢上的稳定性。经过多代复制，的稳定性。经过多代复制，DNA的多核苷的多核苷酸链仍可以保持完整，并存在于后代而不酸链仍可以保持完整，并存在于后代而不被分解掉。被分解掉。 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国DNA的半保留复制实验依据 19581958年年Mesel

8、son & stahlMeselson & stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验, ,证明了证明了DNADNA是采取半保留的方式进行复制是采取半保留的方式进行复制.楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Cairns实验实验) 将将3H-胸苷标记大肠杆菌胸苷标记大肠杆菌DNA，经过近两代的时间，经过近两代的时间，3H-胸苷掺入大肠杆胸苷掺入大肠杆菌菌DNA 。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体。用溶菌酶把细胞壁消化掉，

9、使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分占整个染色体的三分之二，其中射性链和一股非放射性链构成。已复制部分占整个染色体的三分之二，其中一条双链（一条双链（ B ）仅有一股链是标记的，另外一股双链（）仅有一股链是标记的，另外一股双链（ A ）的两股链都是）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为1100微米。微米。ABC环状环状DNA的复制的复制 ABC(1) D

10、NA(1) DNA聚合酶聚合酶(DNA polymerases)(DNA polymerases)(2) (2) 引物酶引物酶(primase)(primase)和引发体和引发体(primosome) (primosome) ：启动：启动RNARNA引物链的合引物链的合成。成。(3) DNA(3) DNA连接酶（连接酶（DNA ligaseDNA ligase）(4) DNA(4) DNA解链酶解链酶(DNA helicase)(DNA helicase)(5) (5) 单链结合蛋白单链结合蛋白(single-strand (single-strand binding protein,SSBP

11、)binding protein,SSBP)：结合在解：结合在解开的开的DNADNA单链上，防止重新形成双螺单链上，防止重新形成双螺旋。旋。 (6) (6) 拓扑异构酶拓扑异构酶(topoisomerase):(topoisomerase):兼具内切酶和连接酶活力，能迅速兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将将DNADNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。松驰状态，便于解链。解旋酶解旋酶DNA聚聚合酶合酶III解链酶解链酶RNA引物引物引物酶和引物酶和引发体引发体DNA聚聚合酶合酶ISSB3 3 5 3 5 5 RNA引物引物大肠杆菌的引物酶也是大肠杆菌的引物酶

12、也是DNADNA复制所必需的一种酶。复制所必需的一种酶。该酶由一条多肽链组成，该酶由一条多肽链组成，MWMW为为60 KD60 KD，每个细胞中，每个细胞中有有50-10050-100个分子由大肠杆菌的个分子由大肠杆菌的dnaGdnaG基因编码。引物基因编码。引物酶催化引物酶催化引物RNARNA分子的合成，但它和传统的分子的合成，但它和传统的RNARNA聚合聚合酶不一样。酶不一样。11引物酶对雷米封不敏感，而引物酶对雷米封不敏感，而RNARNA聚合聚合酶则敏感酶则敏感;2;2引物酶既可以利用核糖核苷酸，而引物酶既可以利用核糖核苷酸，而RNARNA聚合酶只能利用核糖核苷酸聚合酶只能利用核糖核苷酸

13、;3;3引物酶只在复引物酶只在复制起点处合成制起点处合成RNARNA引物而引发引物而引发DNADNA的复制，而的复制，而RNARNA聚聚合酶则是启动合酶则是启动DNADNA转录合成转录合成RNARNA从而将遗传信息由从而将遗传信息由DNADNA传递到传递到RNARNA。但在单链噬菌体。但在单链噬菌体M13DNAM13DNA和质粒和质粒Co1E1DNACo1E1DNA复制时，引物的合成是由复制时，引物的合成是由RNARNA聚合酶催化聚合酶催化的。噬菌体的。噬菌体T7T7的的Gene4Gene4蛋白，蛋白，T4T4的的Gene41Gene41和和6161蛋白蛋白等也具有引物酶的活性和具有大肠杆菌引

14、物酶相似等也具有引物酶的活性和具有大肠杆菌引物酶相似的功能。的功能。 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国DNADNA在细胞内往往以超螺旋状态存在，在细胞内往往以超螺旋状态存在，DNADNA拓扑酶催化同一拓扑酶催化同一DNADNA分子不同超螺分子不同超螺旋状态之间的转变。旋状态之间的转变。DNADNA拓扑异构酶有拓扑异构酶有两类，大肠杆菌的两类，大肠杆菌的蛋白蛋白(MW-110000)(MW-110000)就是一种典型的拓扑异构酶就是一种典型的拓扑异构酶.它的作它的作用是暂时切断一条用是暂时切断一条DNADNA链，形成酶链，形成酶-DNA-DNA共价中间物而使

15、超螺旋共价中间物而使超螺旋DNADNA松弛化，然松弛化，然后再将切断的单链后再将切断的单链DNADNA连接起来，而不连接起来，而不需要任何辅助因子。而大肠杆菌中的需要任何辅助因子。而大肠杆菌中的DNADNA旋转酶旋转酶(DNA gyrase)(DNA gyrase)则是典型的拓则是典型的拓扑异构酶扑异构酶，能将负超螺旋引入，能将负超螺旋引入DNADNA分分子，该酶能暂时性地切断和重新连接子，该酶能暂时性地切断和重新连接双链双链DNADNA，同时需要，同时需要ATPATP水解为水解为ADPADP以供以供能。能。 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国单链单链DNA

16、结合蛋白结合蛋白(SSBP) 螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生了一段单链区，但是这种单链螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生了一段单链区，但是这种单链DNADNA不会长久存在，会很快重新配对形成双链不会长久存在，会很快重新配对形成双链DNADNA或被核酸酶降解或被核酸酶降解。在细胞内有大量单链。在细胞内有大量单链DNADNA结合蛋白能很快地和单链结合蛋白能很快地和单链DNADNA结合，防结合，防止其重新配对形成双链止其重新配对形成双链DNADNA或被核酸酶降解。一个或被核酸酶降解。一个SSBPSSBP四聚体结四聚体结合于单链合于单链DNADNA上可以促进其他上可以促进其他SSBPSSBP四聚体现相邻的

17、单链四聚体现相邻的单链DNADNA结合，结合，这个过程称为协同结合这个过程称为协同结合(cooperative binding)(cooperative binding)，SSBPSSBP结合到单结合到单链链DNADNA上后，使其呈伸展状态，没有弯曲和结节，有利于单链上后，使其呈伸展状态，没有弯曲和结节，有利于单链DNADNA作为模板。作为模板。SSBPSSBP可以重复使用，当新生的可以重复使用，当新生的DNADNA链合成到某一位置链合成到某一位置时，该处的时，该处的SSBPSSBP便会脱落，并被重复利用。便会脱落，并被重复利用。 螺旋酶（螺旋酶（helicasehelicase）可以促使）可

18、以促使DNADNA在复制叉处打在复制叉处打开双链。螺旋酶可以和单链开双链。螺旋酶可以和单链DNADNA结合，并且与结合，并且与ATPATP结合，利用结合，利用ATPATP分解成分解成ADPADP时产生的能量沿时产生的能量沿DNADNA链向前运动促使链向前运动促使DNADNA双链打开。目前，大肠双链打开。目前，大肠杆菌中发现有两种螺旋酶参与这个过程，一种杆菌中发现有两种螺旋酶参与这个过程，一种称为螺旋酶称为螺旋酶或螺旋酶或螺旋酶，与前导链的模板，与前导链的模板DNADNA结合沿结合沿5353方向运动方向运动; ;第二种称为第二种称为RepRep蛋白，蛋白，和前导链的模板和前导链的模板DNADNA

19、结合沿结合沿3535方向运动。方向运动。 DNA聚合酶催化的链延长反应聚合酶催化的链延长反应5 RNA引物引物子链3 355335533 5 模板链DNA聚合酶聚合酶(DNA Polymerase) 共同性质共同性质 1以脱氧核苷酸三磷酸以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成为前体催化合成DNA;2需要模板和引物的存在需要模板和引物的存在;3不能起始合成新的不能起始合成新的DNA链链;4催化催化dNTP加到生长中的加到生长中的DNA链的链的3-OH末端末端;5催化催化DNA合成的方向是合成的方向是53。 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国大肠杆菌三种大

20、肠杆菌三种DNA聚合酶比较聚合酶比较DNA聚合酶聚合酶分子量分子量每个细胞的分子统计数每个细胞的分子统计数5 -3 聚合酶作用聚合酶作用3 -5 核酸外切酶作用核酸外切酶作用5 -3 核酸外切酶作用核酸外切酶作用转化率转化率DNA聚合酶聚合酶109，000400+1120，000100+-0 .05400，00010-20+-50比较项目比较项目DNA聚合酶聚合酶切除引物切除引物修复修复修复修复复制复制功能功能 1999年发现聚合酶年发现聚合酶 和和，它们涉及，它们涉及DNA的错误倾的错误倾向修复（向修复（error-prone repair）大肠杆菌DNA聚合酶 (DNA pol ) 大肠杆

21、菌每个细胞中只有大肠杆菌每个细胞中只有10-2010-20个个DNA pol 分子，分子，该酶对模板的要求与该酶对模板的要求与DNADNA聚合酶聚合酶相同，最适模板相同，最适模板也是链也是链DNADNA中间有空隙的单链中间有空隙的单链DNADNA，单链结合蛋白可，单链结合蛋白可以提高该酶催化单链以提高该酶催化单链DNADNA模板的模板的DNADNA聚合作用。聚合作用。DNA DNA pol pol 也有也有3535和和5353外切酶活性，但是外切酶活性，但是3535外切酶活性的最适底物是单链外切酶活性的最适底物是单链DNADNA，只产生，只产生5-5-单核苷酸，不会产生二核苷酸，即每次只能从单

22、核苷酸，不会产生二核苷酸，即每次只能从33端开始切除一个核苷酸。端开始切除一个核苷酸。5353外切酶活性也要外切酶活性也要求有单链求有单链DNADNA为起始作用底物，但一旦开始后，便为起始作用底物，但一旦开始后，便可作用于双链区。可作用于双链区。 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶(DNApol) 1970年发现了DNA pol 。此酶MW为120 KD，每个细胞内约有100个酶分子，但活性只有DNA pol的5%。 (1)(1)聚合作用聚合作用: :该酶催化该酶催化DNADNA的聚合，但是对模板的聚合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最适模板是双链有特殊的要求。该酶的最适模板是双链DNADNA

23、而中间而中间有空隙有空隙(gap)(gap)的单链的单链DNADNA部份，而且该单链空隙部份部份，而且该单链空隙部份不长于不长于100100个核苷酸。对于较长的单链个核苷酸。对于较长的单链DNADNA模板区该模板区该酶的聚合活性很低。酶的聚合活性很低。(2)(2)该酶具有该酶具有3535外切酶活性，但无外切酶活性，但无5353外切外切酶活性。酶活性。楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国(3)该酶对作用底物的选择性较强，一般只能将该酶对作用底物的选择性较强，一般只能将2脱氧核苷酸掺入到脱氧核苷酸掺入到DNA链中。链中。(4)该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷

24、的该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷的大肠杆菌突变株的大肠杆菌突变株的DNA复制都正常。可能在复制都正常。可能在DNA的损伤修复中该酶起到一定的作用。的损伤修复中该酶起到一定的作用。楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 这 是 1 9 5 6 年 由 A r t h u r Kornberg首先发现的DNA聚合酶，又称Kornberg酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点。 DNA Pol在空间结构上近似球体，直径约6.5 nm。在酶的纵轴上有一个约20A的深沟(cleft)，带有正电荷，这是该酶的活性中心

25、位置，在此位置上至少有6个结合位点: 1 模板DNA结合位点; 2 DNA生长链或引物结合位点; 3 引物末端结合位点，用以专一引物或DNA生长链的3-OH; 4 脱氧核苷三磷酸结合位点; 5 53外切酶活性位点，用以结合生长链前方的5-端脱氧核苷酸并切除之; 6 35外切酶活性位点，用以结合和切除生长链上未配对的 1聚合作用在引物RNA3-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNA pol逐个将核苷酸加上去，就是DNA pol的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3-OH与5-P

26、O4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3-5外切酶活性位点所识别并切除之。 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国235外切酶活性校对作用这种酶活性的主要功能是从35方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国353外切酶活性切除修复作用从53方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激53外切酶活力达10

27、倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5末端DNA引物的去除依赖此种外切酶活性。 4焦磷酸解作用DNA pol 的这种活性可以催化3末端焦磷酸解DNA分子。这种作用就是无机焦磷酸分解DNA生长链，可以认为是DNA聚合作用的逆反应，而且这种水解DNA链作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi (dNMP)n-x+X(dNPPP)DNA 5焦磷酸交换作用催化dNTP末端的PPi同无机焦磷酸的交换反应。反应式为32P32Pi+dNPPPdNP32P32P+PPiDNA （4、5两种作用，都要求有较高浓度的PPi，因此，在体内由于没有足够高的PPi而无重要

28、意义。 ）DNA pol的DNA聚合酶活性和53外切酶活性协同作用，可以使DNA链上的切口向前推进，即没有新的DNA合成，只有核苷酸的交换。这种反应叫缺口平移(Nick translation)。当双链DNA上某个磷酸二酯键断裂产生切口时，DNA pol I能从切口开始合成新的NDA链，同时切除原来的旧链。这样，从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的新链。如果新掺入的脱氧核苷酸三磷酸为-32P-dNTP，则重新合成的新链即为带有同位素标记的DNA分子，可以用作探针进行分子杂交实验。 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶全

29、酶的结构和功能全酶的结构和功能 延长因子延长因子DNADNA聚合酶聚合酶 两个两个 亚基夹住亚基夹住DNADNADNADNA聚合酶聚合酶异二聚体异二聚体核心酶核心酶校对校对引物的结引物的结合和识别合和识别促使核心促使核心酶二聚化酶二聚化连连接接酶酶连连接接切切口口Mg2+连接酶连接酶ATP或或NADAMP+PPi或或NMN+AMPATCGPTTPPPA A CCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPA A CCTGAPACPPPTGGP缺口33555533模板链模板链模板链模板链DNA连接酶利用NAD或ATP中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键。 (1)NAD(1)NAD+ +

30、或或ATPATP将其腺苷酰基转移将其腺苷酰基转移到到DNADNA连接酶的一个赖氨酸残基连接酶的一个赖氨酸残基的的氨基上形成共价的酶氨基上形成共价的酶- -腺腺苷酸中间物，同时释放出烟酰胺苷酸中间物，同时释放出烟酰胺单核苷酸单核苷酸(NMN)(NMN)或焦磷酸。或焦磷酸。(2)(2)将酶将酶- -腺苷酸中间物上的腺苷腺苷酸中间物上的腺苷酰基再转移到酰基再转移到DNADNA的的5-5-磷酸基端磷酸基端，形成一个焦磷酰衍生物，即，形成一个焦磷酰衍生物，即DNA-DNA-腺苷酸腺苷酸; ;(3)(3)这个被激活的这个被激活的5-5-磷酰基端可磷酰基端可以和以和DNADNA的的3-OH3-OH端反应合成

31、磷酸端反应合成磷酸二酯键，同时释放出二酯键，同时释放出AMPAMP。 环状环状 DNA复制时复制时所形成的所形成的结构结构起始点起始点复制叉的推进复制叉的推进复制叉复制叉起始点起始点起始点起始点起始点起始点复制叉复制叉复制叉复制叉未复制未复制DNA单向复制单向复制双向复制双向复制DNA的的双向和单向复制双向和单向复制定点起始，复制方向大多数是双向的（等速进行或定点起始，复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。形成一个复制叉。 复制方向复制方向用放射自显影实验判断DNA的复制方向及速度 DNA的几种

32、复制方式的几种复制方式 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国DNA的几种复制方式的几种复制方式 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国亲代双链（或单链）亲代双链（或单链）DNADNA的一条链在的一条链在DNADNA复制复制起点处被切开，其起点处被切开，其55端游离出来。端游离出来。DNADNA聚合聚合酶酶便可以将脱氧核糖核苷酸聚合在便可以将脱氧核糖核苷酸聚合在3-OH3-OH端。当复制向前进行时，亲代端。当复制向前进行时，亲代DNADNA上被切断上被切断的的55端继续游离下来，并且很快被单链结合端继续游离下来，并且很快被单链结合

33、蛋白所结合。因为蛋白所结合。因为55端从环上向下解链的同端从环上向下解链的同时伴有环状双链时伴有环状双链DNADNA环绕其轴不断的旋转，环绕其轴不断的旋转，而且以而且以3-OH3-OH端为引物的端为引物的DNADNA生长链则不断地生长链则不断地以另一条环状以另一条环状DNADNA链为模板向前延伸，因而链为模板向前延伸，因而称为滚环称为滚环(Rolling circle)复制。复制。 在这种复制方式中，在这种复制方式中，DNA的延伸可以一直进行的延伸可以一直进行下去，产生的下去，产生的DNA链可以是亲代链可以是亲代DNA单位长度单位长度的许多倍。这么长的的许多倍。这么长的DNA链是如何转变为单位

34、链是如何转变为单位长度的长度的DNA分子的，目前尚不清楚。可能是由分子的，目前尚不清楚。可能是由特异的内切酶切开产生单位长度的子代特异的内切酶切开产生单位长度的子代DNA。这些这些DNA可自身环绕，或保持线性分子状态。可自身环绕，或保持线性分子状态。 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国双链环在固定点解开进行复制，但两条链的双链环在固定点解开进行复制，但两条链的合成是高度不对称的，一条链先复制，另一合成是高度不对称的，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代，在电镜下可以看到条链保持单链而被取代，在电镜下可以看到呈呈D D环形状。待一条链复制到一定程度，露环形状

35、。待一条链复制到一定程度，露出另一链的复制起点，另一条链才开始复制出另一链的复制起点，另一条链才开始复制。这表明复制起点是以一条链为摸板起始合。这表明复制起点是以一条链为摸板起始合成成DNADNA的一段序列；两条链的起点并不总在的一段序列；两条链的起点并不总在同一点上，当两条链的起点分开一定距离时同一点上，当两条链的起点分开一定距离时就产生就产生D D环（环（D-loopD-loop）复制。）复制。楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国多复制叉复制多复制叉复制 第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。轮的复制。 楚雄

36、师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国不需要不需要RNA引物的引物的DNA复制复制 有些病毒的基因组是线性有些病毒的基因组是线性DNADNA，在原核细胞和真核，在原核细胞和真核细胞中复制时不需要细胞中复制时不需要RNARNA引物。目前了解最清楚的引物。目前了解最清楚的是腺病毒是腺病毒DNADNA和枯草杆菌噬菌体和枯草杆菌噬菌体29DNA29DNA的复制。的复制。 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国在这些在这些DNADNA复制时，从一端开始，只能利用一条复制时，从一端开始，只能利用一条DNADNA链作为模链作为模板，即以板，即以35

37、35链为模板。这样，新合成的链为模板。这样，新合成的DNADNA链便将原来的链便将原来的亲代亲代DNADNA链取代子链。原来的亲代链取代子链。原来的亲代DNADNA链链( (从合成起始端看是从合成起始端看是5353链链) )作为单链从双螺旋中释放出来。这条链自身的作为单链从双螺旋中释放出来。这条链自身的55和和33可以互补配对，然后在可以互补配对，然后在33端开始以此链为模板重新合成另端开始以此链为模板重新合成另一条子链。这样，一条子链。这样，DNADNA复制即完成。产生两个与亲代复制即完成。产生两个与亲代DNADNA完成完成一样的子代一样的子代DNADNA。 DNA聚合酶不能从头开始合成聚合

38、酶不能从头开始合成DNA链，需要有引物链，需要有引物才能聚合核苷酸生成才能聚合核苷酸生成DNA链。那么，腺病毒和链。那么，腺病毒和29DNA等没有等没有RNA引物是怎样启动其引物是怎样启动其DNA复制的复制的呢呢?研究发现，所有的腺病毒研究发现，所有的腺病毒DNA生长链上都有一生长链上都有一个特异的蛋白质分子附着在其个特异的蛋白质分子附着在其5末端的胞嘧啶核苷末端的胞嘧啶核苷酸上。在酸上。在DNA复制开始之前，该末端蛋白质通过共复制开始之前，该末端蛋白质通过共价键与价键与dCMP的的5磷酸基相连。胞嘧啶通过碱基配磷酸基相连。胞嘧啶通过碱基配对与腺病毒对与腺病毒DNA模板模板3末端的鸟嘌呤核苷酸

39、配对结末端的鸟嘌呤核苷酸配对结合，然后由病毒本身编码的合，然后由病毒本身编码的DNA聚合酶以此末端蛋聚合酶以此末端蛋白白-dCMP复合物为引物连续合成腺病毒整个基因组复合物为引物连续合成腺病毒整个基因组的的36000个核苷酸，在个核苷酸，在DNA复制过程中，由于复制过程中，由于DNA链被置换而产生了扭曲张力链被置换而产生了扭曲张力(torsional strain)，但细，但细胞内拓扑异构酶胞内拓扑异构酶可以消除张力。病毒自身编码的可以消除张力。病毒自身编码的72KD的单链结合蛋白可能也同时具有螺旋酶的功的单链结合蛋白可能也同时具有螺旋酶的功能促进能促进DNA双链的解开。双链的解开。 DNA的

40、复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制起的复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。 复制起点是以一条链为模板起始复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上列。有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上（如（如D环复制）。环复制）。在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。一次，完成一次复制过程。多数生物的复制起点，都是多数生物的复制起点，都是DNA呼吸作用强烈（甲呼吸作用强烈（甲醛变性实验

41、）的区段，即经常开放的区段，富含醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，富含AT。 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国复制子复制子(Replicon)：Genome能独立进行复制的单位，每能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。个复制子都含有一个复制起点。原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固定的起环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对

42、称复制，少数是不对称复制（一条链复制制。多数是对称复制，少数是不对称复制（一条链复制后才进行另一条链的复制）。后才进行另一条链的复制）。环状环状DNA的复制眼象的复制眼象，称，称形复制。形复制。真核生物的染色体真核生物的染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有起点，因此是多复制子，每个复制子约有100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有人体细胞平均每个染色体含有1000个复制子。个复制子。病毒病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。单复制子。 用遗传学和生物化学的方

43、法可以确定大肠杆菌染色体用遗传学和生物化学的方法可以确定大肠杆菌染色体DNADNA的复制的复制起点起点oriCoriC在基因图谱上的位置。在一个生长的群体中几乎所有的在基因图谱上的位置。在一个生长的群体中几乎所有的染色体都在复制过程中，因此离复制起点越近的基因出现频率越染色体都在复制过程中，因此离复制起点越近的基因出现频率越高，越远的基因出现频率越低。将大肠杆菌提取出来的高，越远的基因出现频率越低。将大肠杆菌提取出来的DNADNA切成切成大约大约1 1染色体长度的片段，通过分子杂交的方法测定各基因片染色体长度的片段，通过分子杂交的方法测定各基因片段的频率，结果表明段的频率，结果表明oriCor

44、iC位于基因图谱的位于基因图谱的ilvilv位点处。一旦复制位点处。一旦复制开始以后，复制叉向两侧以相等速度向前移动，两个复制又在起开始以后，复制叉向两侧以相等速度向前移动，两个复制又在起点点180180的的trptrp位点处位点处(33(33分附近分附近) )相会合。相会合。大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列GATCTNTTNTTT成串排列的成串排列的三个三个13 bp序序列列共有序列共有序列共有序列共有序列TTATCCACA DnaA蛋白结合位点蛋白结合位点四个四个9 bp序列序列DnaADnaB(解螺旋酶解螺旋酶)SSB大肠杆菌大肠杆菌DNA复制起点在起

45、始阶段的结构模型复制起点在起始阶段的结构模型原核细胞DNA的半不连续复制复制过程复制叉的复制叉的移动方向移动方向解旋酶解旋酶DNA聚聚合酶合酶III解链酶解链酶RNA引物引物引物体引物体DNA聚聚合酶合酶ISSB3 3 5 前导链前导链随后链随后链3 5 复制的起始（引发）复制的起始（引发）DNADNA链的延长链的延长DNADNA链终止链终止5 RNA引物引物3 3 DNA复制动画1、2DNADNA新生链的合成由新生链的合成由DNADNA聚合酶聚合酶所催化，然而，所催化，然而，DNADNA必须由螺必须由螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链。这样就产生了一种拓扑学旋酶在复制叉处边移动边解开双链。这样

46、就产生了一种拓扑学上的问题上的问题: :由于由于DNADNA的解链，在的解链，在DNADNA双链区势必产生正超螺旋，双链区势必产生正超螺旋，在环状在环状DNADNA中更为明显，当达到一定程度后就会造成复制叉难中更为明显，当达到一定程度后就会造成复制叉难再继续前进，从而终止再继续前进，从而终止DNADNA复制。有两种机制可以防止这种现复制。有两种机制可以防止这种现象发生象发生:1 DNA:1 DNA在生物细胞中本身就是超螺旋，当在生物细胞中本身就是超螺旋，当DNADNA解链而解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和;2 DNA;2 DNA

47、拓扑异构酶拓扑异构酶可以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状可以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态，而态，而DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶(旋转酶旋转酶) )可以在可以在DNADNA解链前方不停地继解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链续将负超螺旋引入双链DNADNA。在在DNA复制叉处要能由两套复制叉处要能由两套DNA聚合酶聚合酶在同一时在同一时间分别进行复制间分别进行复制DNA前导链和滞后链。如果滞后链前导链和滞后链。如果滞后链模板环绕模板环绕DNA聚合酶聚合酶全酶，并通过全酶，并通过DNA聚合酶聚合酶，然后再折向与未解链的双链，然后再折向与未解链的双链DNA在同一方向上，在同一方

48、向上，则则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向上滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行进行。 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国这样，当这样，当DNA聚合酶聚合酶沿着滞后链模板移动时，沿着滞后链模板移动时，由特异的引物酶催化合成的由特异的引物酶催化合成的RNA引物即可以由引物即可以由DNA聚合酶聚合酶所延伸。当合成的所延伸。当合成的DNA链到达前一链到达前一次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模板及刚合次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模板及刚合成的冈崎片断便从成的冈崎片断便从DNA聚合酶聚合酶上释放出来。这上释放出来。这时，由于复制叉继续向前运动，便

49、产生了又一段时，由于复制叉继续向前运动，便产生了又一段单链的滞后链模板，它重新环绕单链的滞后链模板，它重新环绕DNA聚合酶聚合酶全全酶，并通过酶，并通过DNA聚合酶聚合酶开始合成新的滞后链冈开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这样的机制，前导链的合成不会超崎片段。通过这样的机制，前导链的合成不会超过滞后链太多过滞后链太多(最后只有一个冈崎片段的长度最后只有一个冈崎片段的长度)。而。而且，这样引发体在且，这样引发体在DNA链上和链上和DNA聚合酶聚合酶以同以同一速度移动。一速度移动。 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国按上述按上述DNA复制的机制，在复制叉附近，形

50、成了以复制的机制，在复制叉附近，形成了以两套两套DNA聚合酶聚合酶全酶分子、引发体和螺旋构成的全酶分子、引发体和螺旋构成的类似核糖体大小的复合体，称为类似核糖体大小的复合体，称为DNA复制体复制体(replisome)。复制体在。复制体在DNA前导链模板和滞后链模前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的板上移动时便合成了连续的DNA前导链和由许多冈前导链和由许多冈崎片段组成的滞后链。在崎片段组成的滞后链。在DNA合成延伸过程中主要合成延伸过程中主要是是DNA聚合酶聚合酶的作用。当冈崎片段形成后，的作用。当冈崎片段形成后，DNA聚合酶聚合酶通过其通过其53外切酶活性切除冈崎片段上外切酶活性切

51、除冈崎片段上的的RNA引物，同时，利用后一个冈崎片段作为引物引物，同时，利用后一个冈崎片段作为引物由由53合成合成DNA。最后两个冈崎片段由。最后两个冈崎片段由DNA连接连接酶将其接起来，形成完整的酶将其接起来，形成完整的DNA滞后链。滞后链。 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国复制的引发复制的引发(Priming)阶段包括阶段包括DNA复制起点双链复制起点双链解开，通过转录激活步骤合成解开，通过转录激活步骤合成RNA分子，分子，RNA引引物的合成，物的合成，DNA聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物引物RNA的的3-OH末端复制引发

52、的关键步骤就是末端复制引发的关键步骤就是前导链前导链DNA的合成，一旦前导链的合成，一旦前导链DNA的聚合作用的聚合作用开始，滞后链上的开始，滞后链上的DNA合成也随着开始。合成也随着开始。 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国DNADNA复制开始时，复制开始时，DNADNA螺旋酶首螺旋酶首先在复制起点处将双链先在复制起点处将双链DNADNA解解开，然后单链开，然后单链DNADNA结合蛋白质结合蛋白质结合在被解开的链上。由复制结合在被解开的链上。由复制因子因子X(nX(n蛋白蛋白) )，复制因子，复制因子Y(nY(n蛋白蛋白) )，nn蛋白，蛋白，i i蛋白，

53、蛋白，dnaBdnaB蛋白和蛋白和dnaCdnaC蛋白等蛋白等6 6种蛋白质种蛋白质组成的引发前体组成的引发前体(preprimosome)(preprimosome)，在单链，在单链DNADNA结合蛋白的作用下与单链结合蛋白的作用下与单链DNADNA结合生成中间物，这是一种前结合生成中间物，这是一种前引发过程。引发前体进一步与引发过程。引发前体进一步与引物酶引物酶(primase)(primase)组装成引发组装成引发体体(primosome)(primosome)。引发体可以。引发体可以在单链在单链DNADNA上移动，在上移动，在dnaBdnaB亚亚基的作用下识别基的作用下识别DNADNA

54、复制起点复制起点位置。位置。首先在前导链上由引物酶催化合成一段首先在前导链上由引物酶催化合成一段RNARNA引物，引物，然后，引发体在滞后链上沿然后，引发体在滞后链上沿5353方向不停的移方向不停的移动动( (这是一种相对移动，也可能是滞后链模板在移这是一种相对移动，也可能是滞后链模板在移动动) )，在一定距离上反复合成，在一定距离上反复合成RNARNA引物供引物供DNADNA聚合酶聚合酶合成冈崎片段使用，引发体中许多蛋白因子的合成冈崎片段使用，引发体中许多蛋白因子的功能尚不清楚。但是，这些成份必须协同工作才功能尚不清楚。但是，这些成份必须协同工作才能使引发体在滞后链上移动，识别合适的引物合能

55、使引发体在滞后链上移动，识别合适的引物合成位置，并将核苷酸在引发位置上聚合成成位置，并将核苷酸在引发位置上聚合成RNARNA引物引物。由于引发体在滞后链模板上的移动方向与其合。由于引发体在滞后链模板上的移动方向与其合成引物的方向相反，所以在滞后链上所合成的成引物的方向相反，所以在滞后链上所合成的RNARNA引物非常短，一般只有引物非常短，一般只有3-53-5个核苷酸长。而且，在个核苷酸长。而且，在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在，表明引物酶要在DNADNA滞后链模板上比较特定的位滞后链模板上比较特定的位置置( (序列序列) )

56、上才能合成上才能合成RNARNA引物。引物。 为什么需要有为什么需要有RNA引物来引发引物来引发DNA复制呢复制呢?这可这可能尽量减少能尽量减少DNA复制起始处的突变有关。复制起始处的突变有关。DNA复复制开始处的几个核苷酸最容易出现差错，因此，制开始处的几个核苷酸最容易出现差错，因此，用用RNA引物即使出现差错最后也要被引物即使出现差错最后也要被DNA聚合酶聚合酶切除，提高了切除，提高了DNA复制的准确性。复制的准确性。RNA引物形引物形成后，由成后，由DNA聚合酶聚合酶催化将第一个脱氧核苷酸催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在按碱基互补原则加在RNA引物引物3-OH端而进入端而进入DN

57、A链的延伸阶段。链的延伸阶段。 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国聚合酶聚合酶III核心酶核心酶大肠杆菌复制大肠杆菌复制体结构示意图体结构示意图聚合酶聚合酶I聚合酶聚合酶III核心酶核心酶滞后链滞后链前导链前导链解螺旋酶解螺旋酶引物合成酶引物合成酶RNA引物引物引发体引发体拓扑异构酶拓扑异构酶II -夹子夹子 -聚体聚体 -夹子夹子 -复合物复合物RNA引物引物单链结合蛋白单链结合蛋白（SSB）大肠杆菌染色体复制的终止大肠杆菌染色体复制的终止oric复制叉复制叉2复制叉复制叉1终止复制叉终止复制叉2终止复制叉终止复制叉1复制叉复制叉1复制叉复制叉2完成复制完

58、成复制DNA拓扑异构酶拓扑异构酶连锁染色体连锁染色体复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型聚合酶聚合酶III全酶全酶引物引物聚合酶聚合酶III全酶全酶引物引物引物体引物体引物体引物体解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶 DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌计，大肠杆菌DNA复制复制5 109碱基对仅出现一个误碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点: DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为配对原则，但错配率为1

59、0-410-5） DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被聚合酶的校对功能（错配碱基被3 -5 外切酶切除）外切酶切除） 起始时以起始时以RNA作为引物作为引物DNA聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国DNA聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能聚合酶聚合酶错配硷基错配硷基复制方向复制方向正正 确确核苷酸核苷酸5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 切除错配切除错配核苷酸核苷酸起始时以起始时以RNARNA作为引物的作用作为引物的作用 DNADNA复制为什么要合成一个复制为什么要合成一个RNARNA引物，而后又把这引物，而后又把这个引

60、物消除呢？这是保证个引物消除呢？这是保证DNADNA聚合过程高度精确的又一措施。聚合过程高度精确的又一措施。已知已知DNA DNA 聚合酶具有聚合酶具有3 35 5外切酶功能校对复制过程中外切酶功能校对复制过程中的核苷酸的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始始DNADNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时暂时”的，当的，当DNADN