白芷扩增片段长度多态性反应体系的建立及优化

1、白芷扩增片段长度多态性反应体系的建立及优化         作者：陈要臻 郭丁丁 马逾英， 陈雯，王晓东，唐琳 【摘要】 目的建立白芷扩增片段长度多态性（AFLP）反应体系及筛选出扩增条带丰富的引物。方法以12 份白芷为试材,对AFLP 分析过程中包括提取DNA的方法、DNA 的提取质量和浓度、Mse/ EcoR酶切反应时间等进行了研究               &

2、#160;       作者：陈要臻 郭丁丁 马逾英， 陈雯，王晓东，唐琳【摘要】  目的建立白芷扩增片段长度多态性（AFLP）反应体系及筛选出扩增条带丰富的引物。方法以12 份白芷为试材,对AFLP 分析过程中包括提取DNA的方法、DNA 的提取质量和浓度、Mse/ EcoR酶切反应时间等进行了研究，从64对引物中筛选适合白芷的引物。结果改良的CTAB方法提取的DNA质量比较好，建立了一种适于白芷AFLP 银染技术的优化体系：模板DNA 的用量为400 ng ,酶切体系中Mse和EcoR反应时间为4 h，筛选出了7对适合白

3、芷的引物。以引物E+AGC/M+CAA构建的白芷种质资源的AFLP 指纹图谱,扩增带多,多态性强。结论建立了适用于白芷的AFLP反应体系，并筛选出了适合白芷的引物，为今后利用AFLP标记技术进行白芷鉴定及种质遗传多样性分析提供了标准化程序。 【关键词】  扩增片段长度多态性反应体系; 白芷Abstract：ObjectiveTo establish an optimized AFLP(amplified fragment length polymorphism) analysis system of Angelica dahuruica.MethodsThe optimized AF

4、LP analysis system was established with 12 Angelica dahuruica from different habitats after a comparative study of the essential factors which influenced the results of AFLP method. ResultsThe improved CTAB conventional method was better to AFLP than SDS method. The results of the  analysis sys

5、tem showed that 1)the dosage of template DNA was 400ng; 2) the time of digest system was 4h; 3) the products of preamplification should be diluted to 10 times; 4)seven pairs of primer(E+AGC/M+CAA,E+ACT/M+CAC,E+AGC/M+CAC,E+AAC/M+CAC,E+ACC/M+CAC,E+AAC/M+CAG,E+ACC/M+CTC)were selected from 64 pairs by s

6、creening repeatedly. And E+AGC/ M+CAA could amplify more uniform and high sharp bands. ConclusionOur study showed that the AFLP was suitable for genetic diversification,variety identification,construction of molecular map , identification and classification. These results provide fundamentals for fu

7、rther molecular studies of Angelica dahuruica using AFLP marker.Key words：AFLP system;  Angelica dahuruica    扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism, AFLP）技术作为一项分子标记技术，是1992年由荷兰Keygene公司科学家Zabeau Mare和Vos pieter 发明并发展起来的一种选择扩增限制性酶切片段的方法1。AFLP是基于RFLP ( Restriction Fragme

8、nt Length Polymorphism) 和PCR(Polymerase Chain Reaction) 相结合的DNA 分析技术。这种方法是一种选择性扩增限制性片段的方法,它结合了RFLP 和RAPD 的优点,既具有前者的可靠性，又具有后者的方便性。现已被广泛应用于生物多样性、指纹图谱构建、遗传图谱构建、基因克隆等诸多领域2。    白芷Angelica dahurica为伞形科植物，是一种常用中药，性温，味辛，具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓的功效。目前对白芷的研究主要集中在白芷的品质、化学成分、药理作用等方面，其种质资源多样性、亲缘关系等方面的研究也有

9、一些报道3，4，但是运用AFLP技术对白芷基因组的研究还未见报道。因此本研究旨在建立一套适合于白芷的AFLP实验体系，并筛选出多态性强的引物，为进一步研究白芷的遗传多样性、种间亲缘关系AFLP实验奠定基础。1  材料与仪器1.1  材料白芷，2007-04采自四川遂宁GAP基地白芷种质资源圃。材料原产地见表1。样品经成都中医药大学生药教研室马逾英教授鉴定。取新鲜叶片，用硅胶迅速干燥后带回实验室，储于-70冰箱保存。表1  供试材料及来源（略）1.2  试剂EcoR，Mse，T4 DNA ligase，rTaq酶，dNTPs购自TaKaRa宝生物工程（大连

10、）有限公司。Mse IEcoR I接头、Mse IEcoR I核心引物及Mse IEcoR I选择性扩增引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。亲和硅烷、剥离硅烷等购于北京鼎国生物技术有限责任公司。甲叉双丙烯酰胺为瑞士进口分装。其他试剂均为国产分析纯。1.3  仪器Bio-Rad(MC013208)PCR扩增仪，Gene Genius Bio-imaging System凝胶成像仪，北京六一仪器厂生产的DYCZ-20C型垂直电泳系统。2  方法2.1  基因组DNA的提取与DNA质量检测采用CTAB 和SDS 法5,6 ，并进行改良。取3 l总DNA进行1%的琼脂糖

11、凝胶电泳，用Gene Genius Bio-imaging System凝胶成像分析系统检测DNA 质量。然后用UV-VIS Spectrophotometer(Tu-1901) 型紫外分光光度仪分别测定其在260 nm，280 nm处的OD值。纯的DNA溶液OD260/OD280应为1.8。OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染，小于1.6时表明有蛋白质或酚污染7 。合格的DNA浓度等于：OD260×样品稀释倍数×50/1 000。最后统一调整DNA浓度为100 ng·l-1。2.2  白芷AFLP体系的建立AFLP实验流程按邹喻苹8 等

12、的方法进行，并参考他人在其它作物上的反应程序9，10，15 进行优化。2.2.1  基因组DNA的限制性酶切本实验选用EcoR、Mse酶切组合来研究白芷的DNA 多态性水平。于1 500 l的离心管中加入下列物质：10×NEB2 bufer2 5 l，样品DNA模板设计5个等次即100，200，300，400，500 ng，Mse(10 U·l-1) 1.0 l，EcoR (20 U·l-1) 0.6 l，10 ×NEB buffer2 5 l，100BSA 0.5 l，双蒸水补足体积到50 l。为了获得白芷基因组DNA双酶切的最佳时间，将反应

13、液混匀后置于37分别酶切2，4，6 h后，用1的琼脂糖凝胶电泳检测，酶切完后65温浴10 min钝化限制性内切酶。取出后置于4冰箱备用。2.2.2   接头连接取40 l经过酶切的DNA样品，加入EcoR 接头（30 pm·l-1）0.3 l，Mse 接头（33 pm·l-1） 2.0 l，T4DNA ligase(400 U·l-1) 1.2 l， T4 ligase buffer 5.0 l，ddH2O 1.5 l，总体积为50 l。16连接过夜。一部分稀释10倍作为预扩增模板。稀释好的产物和剩余产物置于-20贮存。2.2.3 &

14、#160; 预扩增反应取连接完成的DNA 5 l，加入EcoR 预扩增引物（50 pm·l-1）2.0 l，Mse 预扩增引物（50 pm·l-1）2.0 l，10×PCR buffer(Mg2+ free) 5.0 l，MgCl2（25 mmol·L-1）4.0 l，dNTP（2.5 mmol·L-1）4.0 l，rTaq酶（5 U·l-1) 0.5 l，双蒸水补足体积到50 l。反应液在离心机上低速短暂混匀。扩增程序如下：94 2 min，94 30 s，56 30 s，72 1 min，共30个循环；72 5 min；4 +；反

15、应结束后取5 l PCR产物用1的琼脂糖凝胶电泳检测预扩增效果，然后将预扩增产物稀释1020倍置于-20冰箱保存备用。2.2.4   选择性扩增选择性扩增反应体系为25 l。分别取稀释5，10，15，20倍的预扩增产物各3 l，EcoR选择性引物（50pm·l-1）1.0 l，Mse选择性引物（50 pm·l-1）1.0 l， 10×PCR buffer(Mg2+ free) 2.5 l，MgCl2（25mmol·L-1）2.0 l， dNTPs（2.5 mmol·l-1）2.0l，rTaq酶（5U·l-1) 0.

16、2 l，ddH2O 13.3 l。PCR反应条件：94 2 min，94 30 s，65 30 s，72 1 min ，接下来的12个循环，每个循环降低0.7；94 30 s，55.5 30 s，72 1 min 进行23循环；72 5 min；4 +；反应结束后取5l用1的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，将选择性扩增产物置于-20冰箱保存备用。2.2.5   聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染参照本实验室已成熟的方法9，并稍做修改。取5 l选择性扩增产物加入3 l loading buffer混合，95变性5 min，立即冰浴，Maker也做同样处理。加样前70

17、W恒功率预电泳45 min，使胶板温度达到40以上，然后上样，75W恒功率电泳70 min。固定：电泳结束后，取下胶板，小心分开，把带胶的玻璃板放入10%的2L冰醋酸中固定，放在摇床上低速摇动，30min。用蒸馏水漂洗两次，3 min/次。染色：胶板放入新配置的染色液(2L,2 g AgNO3,3 ml 37%HCHO，2L H2O）中染色30 min。然后用去离子水漂洗10s。显影：胶板转入预冷的显影液(2L,60 g无水碳酸钠，3ml 37%HCHO，400 l 10mg/ml硫代硫酸钠，2L H2O），轻摇至条带清晰（68 min）。终止：用10%的冰醋酸2L定影。最后用蒸馏水漂洗5 m

18、in，室温自然风干。2.2.6   选择性引物筛选AFLP的引物从64 ( 8 × 8 ) 对AFLP 核心引物组(见表2)依次测试，比较指纹图谱的清晰度与多态性。表2  AFLP 选择性扩增引物序列（略）3  结果3.1   模板DNA 的提取对AFLP 而言，模板DNA 的制备是非常重要的一个环节。模板DNA 质量直接关系着实验的成败，因为模板的质量将影响酶切是否充分及以后的连接反应。在实验中提取白芷DNA 采用了CTAB 和SDS 两种方法，基因组DNA在1%琼脂糖凝胶上30min 左右，其结果如图1显示。SDS 法提取的DNA点样孔十分明亮，说明含有较多的杂质，而CTAB 所提DNA无降解，无RNA污染，样品均匀，条带清晰，分子量在2000bp左右，且点样孔周围没有杂质。而且经过测定，CTAB提取的白芷DNA 的OD260/OD280值在1.8左右，SDS法提取的白芷