高效液相色谱荧光法测定人血浆中盐酸阿呋唑嗪浓度

1、    高效液相色谱荧光法测定人血浆中盐酸阿呋唑嗪浓度        要目的:对盐酸阿呋唑嗪血浆药物浓度的测定方法及药物动力学进行了研究。方法:用高效液相色谱法测定，LUNA C18(2)色谱柱，5 m粒径(250 mm×4.6 mm)；测定采用内标峰面积比定量，ex=270 nm，em=370 nm。结果:本方法最佳线性关系为r=0.999 6，线性范围500.78 g.L-1，最低检测浓度为0.7 g.L-1；平均方法回收率98.90%；50，20，1.5 g.

2、L-1的日内精密度分别为3.74%，4.72%，5.68%，日间精密度分别为6.00%，9.43%，10.27%。药物动力学参数分别为：T1/2a=(1.1±0.7) h，T1/2=(5.7±1.4) h，Cmax=(32.4±6.0) g.L-1，Tmax=(1.14±31) h，AUC0t=(218.8±26.0) g.h.L-1。结论:本方法灵敏、准确，可对血浆中盐酸阿呋唑嗪进行测定。关键词盐酸阿呋唑嗪；高效液相色谱法；荧光检测法；药物动力学中分类号：R927.2文献标识码：A文章编号：1001-5213(2000)06-0344-03

3、HPLC for plasma concentration of alfuzosin hydrochlorideLi Yang,Li Kexin,Wang Wei,et al(Clinical Pharmacology Base,Beijing Hospital,Beijing 100730)ABSTRACTOBJECTIVE：A sensitive and precise HPLC for determination of alfuzosin hydrochloride plasma concentration was studied.METHODS：We used LUNA C18 col

4、umn,acetonitrile/0.02 mol.L-1 potassium dihydrogen phosphate(pH=2.5) as a mobile phase.RESULTS：Methodology evaluation showed that alfuzosin hydrochloride plasma concentration between 500.7813 g.L-1 had a good linear coefficient relation (r=0.999 6). The lowest detectable concentration was 0.7 g.L-1.

5、The average recovery of the method was 98.9%.The coefficien variation of within and between-day for the concentration of 50、20 and 1.5 g.L-1 were 3.74%、4.72%、5.68% and 6.00%、9.43%、10.27% respectively.Pharmacokinetics for alfuzosin hydrochloride tablet were T1/2=(1.1±0.7) h，T1/2=(5.7±1.4) h

6、，Cmax=(32.4±6.0) g.L-1，Tmax=(1.14±0.31) h.The area under the curve of concentration versus time after 5 mg oral of alfuzosin hydrochloride tablet was AUC0t=(218.8±26.0) g.h.L-1.CONCLUSIONS：This method provides an accurate way in testing plasma concentration of alfuzosin.KEY WORDSalfuz

7、osin hydrochloride;high-performace liquid chromatography;flavoxate;pharmacokienetics盐酸阿呋唑嗪(alfuzosin hydrochloride)是选择性1肾上腺素能受体拮抗剂，能使尿道和前列腺平滑肌松弛，改善尿流量，从而有效的改善良性前列腺肥大病人的症状1。对于盐酸阿呋唑嗪血浆浓度的测定方法国内目前尚无报道。本试验采用高效液相荧光检测法对盐酸阿呋唑嗪的测定方法进行了摸索，取得了较好的效果。该方法灵敏度高、专属性强、杂质峰少。1材料与方法1.1仪器岛津LC-10AT高效液相色谱系统，RF-10AXL荧光检测器，

8、SP4270型积分仪。1.2药品盐酸阿呋唑嗪片(北京瑞康明药物研究所提供，批号980808，规格2.5 mg/片)；盐酸阿呋唑嗪对照品(北京瑞康明药物研究所提供，含量100.8%)。甲磺酸托氟沙星(内标物)对照品(北京太洋药业有限公司提供，含量99.6%)。试剂：乙腈、叔丁基甲醚(色谱纯)，水(重蒸馏水)，磷酸二氢钾、磷酸(分析纯)。1.3色谱条件检测器波长：ex=270 nm，em=370 nm，色谱柱：LUNA C18柱(5 m粒径，250 mm×4.6 mm)，流动相：乙腈-0.01 mol.L-1磷酸二氢钾(用磷酸调pH至2.5)=13，流速：1.0 ml.min-1，柱温：

9、室温，进样量20 l。1.4标准溶液及内标液的制备精密称取盐酸阿呋唑嗪对照品约50 mg,置100 ml量瓶中用0.01 mol.L-1盐酸溶解，并用蒸馏水加至刻度，混匀，使成为0.5 mg.ml-1的溶液。再精密量取10 ml于50 ml量瓶中，混匀后成为100g.ml-1标准贮备液。精密称取甲磺酸托氟沙星50 mg于100 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，混匀后成为0.5 mg.ml-1的甲磺酸托氟沙星内标液，同法冷藏备用。1.5血浆样品的提取与测定24取空白血浆500 l，置5 ml具塞玻璃离心管中，加入阿呋唑嗪标准贮备液适量，加入内标液100 l，用涡旋混合器振荡0.5 min，

10、分3次加入叔丁基甲醚3 ml，振荡3 min，离心5 min，收集2.5 ml上清液于另一离心管中，3次共7.5 ml，于40 水浴中氮气吹干，100 l流动相溶解后，取20 l进样，测得样品与内标峰面积比，由标准曲线方程计算血浆样品阿呋唑嗪浓度。1.6标准曲线的绘制精密量取阿呋唑嗪标准贮备液(1 g.ml-1)适量，于5 ml刻度管中，加空白血浆2 ml，振荡混匀，使其成50 g.L-1浓度。再依次将血浆稀释成25，12.5，6.25，3.125，1.5625，0.7813 g.L-1系列浓度，取上述标准血浆500 l，甲磺酸托氟沙星内标液100 l，混匀后按1.5项下所示提取方法操作。以已

11、知阿呋唑嗪浓度为横坐标，阿呋唑嗪峰面积(As)与内标峰面积(Ai)之比(As/Ai)为纵坐标绘制标准曲线。1.7药物动力学研究健康志愿者12名，汉族，男性，平均年龄(21.7±3.0)岁，平均体重(65.9±8.5)kg,平均身高(174.3±5.9) cm，肝肾功能、血常规、心率、呼吸及血压正常。志愿者于清晨空腹单次口服相同盐酸阿呋唑嗪片5 mg，100 ml温开水送下，4 h后用统一餐，分别于0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，12，24 h抽取前臂静脉血3 ml，将血标本置于肝素化的试管中，离心(3 000 r.min-1)，分离出血浆，-40

12、 避光保存至测定。1.8数据处理试验测得的药物浓度数据和药物动力学参数采用±s表示， 药物动力学参数采用3P97软件运算，AUC0t值采用统计矩法计算。2结果2.1色谱行为选用ex=270 nm，em=370 nm的检测波长，在所用色谱条件下，基线走动平稳，且对阿呋唑嗪与内标均有较大吸收度；在选用色谱条件下，配制的标准血浆中阿呋唑嗪与内标的保留时间分别为4.44 min和6.68 min，无干扰峰出现。样品血浆中的杂质峰与阿呋唑嗪及内标分离良好，不影响测定结果，色谱见1。1阿呋唑嗪高效液相色谱Rt样=4.44 minRt内=6.68 min2.2线性范围及灵敏度血浆中阿呋唑嗪浓度在5

13、00.78 g.L-1的范围内，标准曲线见2。标准曲线方程为：R=-0.03902+0.06272C，C=浓度，R=As/Ai。Hs： 阿呋唑嗪峰面积；Ai：内标峰面积。相关系数r=0.999 6(n=7,不包括空白)，线性关系良好。在上述条件下，血浆中阿呋唑嗪最低检测浓度为0.7 g.L-1。212名健康志愿者口服5 mg盐酸阿呋唑嗪片后血药浓度均值-时间曲线2.3回收率与精密度试验2.3.1方法回收率空白血浆加入阿呋唑嗪标准贮备液使成50，20，1.5 g.L-1浓度的样品，按上述血样预处理后进样，由标准曲线求出各样品的浓度与已知加入浓度相比，计算方法回收率，每种浓度重复测定5次，按标准曲

14、线方程计算回收率。2.3.2绝对回收率配制3个浓度的阿呋唑嗪液(分别含阿呋唑嗪50，20，1.5 g.L-1)，直接进样20 l，其峰面积作为对照组峰面积。另取3份空白血浆，加入适量标准贮备液，配成含阿呋唑嗪50，20，1.5 g.L-1的血浆样品，并连续配制5次，同上处理，进样20 l，将所得峰面积与对照组相应浓度峰面积比较，计算绝对回收率。每种浓度重复测定5次，回收率结果见表1。表1阿呋唑嗪回收率(n=5)浓度/g.L-1方法回收率/%绝对回收/%50100.4±2.975.5±2.62098.1±3.172.6±1.61.598.3±4.

15、673.6±3.22.3.3精密度空白血浆中加入阿呋唑嗪标准液制成50，20，1.5 g.L-1的样品，每一浓度分别配制5份，按血样处理后测定。日内精密度为一天中测定5次，日间为每天测定一次，且连续测定5 d，计算日内日间精密度，结果见表2。2.4药物动力学参数志愿者血浆按1.5项下所示方法处理、测定。试验结果显示，阿呋唑嗪在健康人体内呈二室开放模型特点，其各点的平均血药浓度及主要的药物动力学参数见表3。表2阿呋唑嗪血药浓度日内、日间精密度(n=5)浓度/g.L-1测定值/g.L-1RSD/%5050.8±1.93.74日内2020.3±1.04.721.51.5

16、±0.15.685051.1±3.16.00日间2019.9±1.99.431.51.5±0.210.27表312健康志愿者单次口服5 mg盐酸阿呋唑嗪片药物动力学参数参数±sT1/2/h1.1±0.7T1/2/h5.7±1.4Cmax/g.L-132.4±6.0Tmax/h1.14±0.31AUC0t/g.h.L-1218.8±26.03讨论 选用甲磺酸托氟沙星作为内标，建立了HPLC荧光检测方法，该方法灵敏、专属性强、保留时间短，完成一次分析时间不足10 min，符合药物动力学研究的要求。本

17、方法的最低检测浓度为0.7 g.L-1， 平均方法回收率在90%以上。精密度考察结果，日内日间RSD小于15%，能够满足药物动力学要求。试验结果发现，阿呋唑嗪在人体的血药浓度及药物动力学参数略高于国外文献报道2.3的结果，可能与研究方法、房室模型的选择等有关。李扬（卫生部北京医院临床药理基地，北京 100730）李可欣（卫生部北京医院临床药理基地，北京 100730）王威（卫生部北京医院临床药理基地，北京 100730）刘蕾（卫生部北京医院临床药理基地，北京 100730）史爱欣（卫生部北京医院临床药理基地，北京 100730）赫广威（卫生部北京医院临床药理基地，北京 100730）孙春华（卫

18、生部北京医院临床药理基地，北京 100730）参考文献1陈新谦，金有豫.新编药物学M.北京：人民卫生出版社，1998，12Guinebault P.BroquaireM.ColafranceschiC.et al.High preformance liquid chromatographic determination of alfuzosin in biological fluids with fluorimetric detection and large-volume injectionJ.Journal of Chromatography,1986,353,351,3613Alain R,Martine M,Alain D,et al.Direct high-performance liquid chromatographic determination of the enantiomers of alfuzosin in plasma on a seco