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文档简介

1、附件6 RT-PCR检测汉坦病毒基因及分型材料：（1）急性期病人血清、鼠肺、鼠血或分离的汉坦病毒（2）引物：引物序列（53）位置片段（bp）逆转录引物TAGTAGTAGACTCC114LMS通用外引物AAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGG19101939M(+)GTACAICCTGTRCCIACCCC23732354M(-)型特异性引物汉滩病毒GAATCGATACTGTGGGCTGCAAGTGC19581984M(+)GGATTAGAACCCCAGCTCGTCTC23182340M()汉城病毒GTGGACTCTTCTTCTCATTATT19361957M(+)TGGGCAA

2、TCTGGGGGGTTGCATG23312353M()S片段引物ATGTTGCCTGGGGIAAAGAGG12001220S(+)GCGCACTAGTAGTAGTAGACTCCCTAAAGA16701696S(-)方法：（1）病毒RNA的提取：采用TRIzol按说明提取，制备模板RNA；（2）逆转录、合成cDNA：采用SuperScripTMII或AMV逆转录酶，按说明书进行；（3）PCR扩增：反应条件为95预变性10分钟，9460秒、5560秒、7245秒、扩增3035个循环，72延伸12分钟。（4）扩增产物用12琼脂糖凝胶电泳鉴定。若条带的分子量与预期片段大小相同，则表明为特异性扩增产物。必要时，可进行：（5）PCR片段的回收和核苷酸序列测定：切下特异分子量条带，用QIAquick凝胶回收试剂盒回收（按其说明书进行），自动测序仪测序。意义：扩增到特异性条带可

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