极性C18-亲水作用色谱-强极性化合物分离专题-2013

1、1极性小分子分离分析极性小分子分离分析专题讲座强极性小分子分析难点1.我的样品是两性极性小分子化合物，反相柱不保留，怎样选择合适的色谱柱分析。关键词：不保留2.我的样品分析条件比较特殊，必须要进行质谱检测，要选择可以进质谱的分析条件。关键词：质谱兼容强极性小分子分析难点中强极性化合物强极性化合物一般极性化合物普通反相模式C18/C8可解决部分化合物在纯水条件下反相模式解决在反相上无保留，正相不溶解，难点问题：疏水塌陷问题：不保留，不溶解强极性小分子分析解决方案C18 甲醇中C18 水中强极性小分子分析解决方案选用亲水性和极性很强的封尾试剂封尾避免疏水塌陷的几个策略选用短链烷基键合相且不对硅醇基

2、封尾选用链长更长的烷基固定相选用大孔硅胶对烷基链固定相进行极性基团嵌入的改造强极性小分子分析解决方案一步法反应较好保持了烷基链的疏水性可调的极性基团种类和数量增加了材料的稳定性Polar-copolymerized极性共聚Polar-embeded 极性包埋Polar-endcapped极性封尾破坏了烷基破坏了烷基链的疏水性链的疏水性两步反应，极性两步反应，极性基团数量不可控基团数量不可控利用极性共聚技术研发出耐水的XAqua 系列色谱柱强极性小分子分析解决方案停流实验强极性小分子分析解决方案原儿茶醛色谱条件：色谱柱：XAqua C18(150 4.6 mm，5m mm)流动相：乙腈：1%醋酸

3、水溶液=5:95；柱温：30C;流速:1.0 mL/min;强极性小分子分析解决方案小分子酸色谱条件：色谱柱：XAqua C18；流动相：100%（0.1%三氟乙酸水）；强极性小分子分析解决方案中性或酸性极性小分子化合物XAqua 系列碱性极性小分子化合物解决XAqua 系列051015200.00.10.20.30.40.5AuRetention Time/min拖尾一般解决办法流动相中加入离子对试剂质谱不兼容强极性小分子分析解决方案碱性化合物拖尾的原因，残余硅醇基与碱性化合物作用造成拖尾针对碱性化合物，研发出专用碱性化合物的分离分析的色谱柱 XCharge 系列设计理念：合理控制电荷密度，

4、设计理念：合理控制电荷密度，形成恰当的电荷屏蔽层，消除硅形成恰当的电荷屏蔽层，消除硅醇基的拖尾影响，实现载样量的醇基的拖尾影响，实现载样量的提升。提升。强极性小分子分析解决方案羟氨苄青霉素色谱条件：色谱柱：XCharge C18；流动相：A 0.1%甲酸水，B0.1%甲酸甲醇；梯度：020 min，5%B95%B强极性小分子分析解决方案磺胺类碱性小分子色谱条件：色谱柱：XCharge C18；流动相：A 0.1%甲酸水，B乙腈；梯度：030 min，5%B95%B强极性小分子分析解决方案超强极性怎么办，反相纯水条件下不保留HILIC 模式XAqua C18流动相：流动相：100%水水XAmid

5、e流动相：流动相：85%乙腈水乙腈水强极性小分子分析解决方案增加保留与反相不同保留机理正交性更好的溶解度和质谱兼容性强极性小分子分析解决方案15.16816.850LSU0.0020.0040.0060.0080.00100.00分钟0.002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.00色谱柱色谱柱：XAmino，250 mm 4.6 mm，5 mm流动相流动相：A:乙腈 B：水等度等度：A/B = 85:15流速流速：1.0 mL/min柱温柱温：35 oC选择性选择性：1.12分离度分离度：3.08甘露醇山梨醇强极性小分子分析解决方案

6、色谱柱色谱柱：XAmide，250 mm 4.6 mm，5 mm流动相流动相：A: 磷酸盐缓冲液 B：乙腈 等度等度：A/B = 30:70流速流速：1.0 mL/min 柱温柱温：35 oC左旋肉碱强极性小分子分析解决方案未知极性小分子化合物XAqua C18拖尾XCharge C18XAmideS-Click XIon不保留拖尾反相模式亲水模式方案特点1.该方案基本适用于所有极性小分子化合物，普试性好。2.该方案所有流动相都可应用于质谱，质谱兼容性好。3.采用两种模式，增加了样品的选择性。强极性小分子分析解决方案样品1样品为某CRO公司提供合成中间体小分子化合物XAqua C18100%甲

7、酸水XCharge C18100%甲酸水S-Click XIon乙腈甲酸铵体系放大图拖尾不保留保留好，分离好强极性小分子分析解决方案样品2样品为某CRO公司提供合成中间体小分子化合物XAqua C18乙腈甲酸水主峰纯度96.55%S-Click XIon乙腈甲酸水主峰纯度84.91%分离度差保留适中分离度良好AU0.000.200.400.600.801.00分钟5.0010.0015.0020.0025.0030.00强极性小分子分析解决方案样品3样品为某CRO公司提供合成中间体小分子化合物XAqua C18100%甲酸水主峰纯度96.55%XCharge C18100%甲酸水主峰纯度96.

8、55%分离度差保留弱分离度差保留适中分离度良好22亲水作用色谱与中药中强极性化合亲水作用色谱与中药中强极性化合物的分离物的分离专题讲座主要内容亲水作用色谱保留机理及特点亲水作用色谱保留机理及特点亲水作用色谱影响因素及应用亲水作用色谱影响因素及应用中药中强极性化合物的分离中药中强极性化合物的分离研究方向研究方向强极性化合物的分离强极性化合物的分离反相色谱反相色谱正相色谱正相色谱溶解度溶解度与质谱联用与质谱联用？A.J. Alpert, J. Chromatogr., 499 (1990) 177.亲水作用色谱亲水作用色谱HILIC亲水作用色谱机理及特点亲水作用色谱机理及特点亲水作用色谱亲水作用色

9、谱 亲水作用色谱法的分离原理与正相色谱法相近的极性固定相、以高比例极性有机溶剂和低比例水的混合溶液为流动相，主要用于极性化合物的分离。被分析物质在色谱柱中的保留和其自身的极性成正比，和流动相的极性成反比。被分析物质的极性越强，在色谱柱中保留越强。增加流动相中水的比例，使流动相极性增强，则分析物保留减弱。亲水色谱固定相亲水色谱固定相( 1) 传统的正相色谱固定相，包括纯硅胶固定相、氨基键合相、二醇基键合相、氰基固定相。该类固定相对糖、有机酸、核苷等强极性化合物表现出良好的分离选择性; ( 2) 离子交换固定相，该类固定相具有很好的亲水性，表面带有较强的表面电荷，用于亲水作用色谱时表现为一种离子交

10、换( 或排斥) /亲水作用混合色谱模式; ( 3) 专门应用于亲水作用色谱的固定相，包括酰胺类固定相、醇羟基固定相和两性离子固定相。酰胺类固定相可用于分离核苷、核苷酸、肽、糖、糖醇及有机酸等亲水化合物; 醇羟基固定相适合于分离各种糖，如单糖、二糖、糖醇、寡糖及碱基、核苷、肽和中药中的强极性组分。min010203040mAU0100200300400500强极性化合物反相模式分离ODS Column 1.000mL/minA: 0.1% 甲酸甲酸/ /水水 B: 乙腈乙腈 时间/分钟03050B/%53070亲水作用色谱机理及特点亲水作用色谱机理及特点川芎强极性成分反相模式分离，川芎强极性成分

11、反相模式分离，UV检测检测（260nm）吸附吸附亲水作用色谱保留机理亲水作用色谱机理及特点亲水作用色谱机理及特点分配分配极性固定相极性固定相富水层富水层流动相流动相极性固定相极性固定相溶质溶质A. J. Alpert, J. Chromatogr., 499 (1990) 177.Y. Guo, J. Chromatogr. A 1074（2005）71Y. Guo, J. Pharm. Biomed. Anal. 31（2003）1191T.Yoshida, J. Biochem. Biophys. Meth. 60（2004）265反相液相色谱反相液相色谱正相液相色谱正相液相色谱毛细管电色

12、谱毛细管电色谱 离子对色谱离子对色谱亲水作用色谱特点HILIC强极性组分强极性组分亲水作用色谱机理及特点亲水作用色谱机理及特点好的保留好的保留好的溶解度好的溶解度流动相简单流动相简单大的制备规模大的制备规模亲水作用色谱影响因素固固 定定 相相有有 机机 溶溶 剂剂缓缓 冲冲 盐盐pH柱柱 温温亲水作用色谱影响因素及应用亲水作用色谱影响因素及应用(A) Keystone Carbohydrate, (B) Asahipak NH2P,(C) BetaBasic Cyano, (D) Metasil Cyano, (E) TSKGel Amide-80,(F) Cyclobond III, (G)

13、 Polyhydroxyethyl Aspartamide 0-40min， ACN：90-75%；40-80min，ACN：75%terreic acidoosporeinguanine nocardicin Acephalosporin Cvancomycin固定相对亲水模式分离的影响M. A. Strege, Anal. Chem. 70 (1998) 2439亲水作用色谱影响因素及应用亲水作用色谱影响因素及应用有机溶剂对亲水模式分离的影响(1) epidaunorubicin, (2) daunorubicin, (3) epirubicin, (4) doxorubicinKroma

14、sil KR100-5SIL 10% HCOONa buffer (20 mM, pH 2.9)R. P. Li, J. Chromatogr. A, 1041 (2004) 163亲水作用色谱影响因素及应用亲水作用色谱影响因素及应用有机溶剂对亲水模式分离的影响aspirincytosineTSKgel Amide-80YMC-Pack NH2HILIC Silica ZIC-HILIC5mM ammonium acetate，30Y. Guo, J. Chromatogr. A 1074（2005）71亲水作用色谱影响因素及应用亲水作用色谱影响因素及应用缓冲盐对亲水模式分离的影响亲水作用色谱

15、影响因素及应用亲水作用色谱影响因素及应用terreic acidoosporeinguanine nocardicin Acephalosporin CvancomycinA: 6.5mM 三氟乙酸；三氟乙酸；B: 7.9mM 甲酸铵甲酸铵 pH 4.4C: 6.5mM 乙酸铵乙酸铵 pH 5.5；D: 6.3mM 碳酸氢铵碳酸氢铵 pH 7.9TSK Gel Amide 80 column0-40min， ACN：90-75%；0-80min，ACN：75%M. A. Strege, Anal. Chem. 70 (1998) 2439pH对亲水模式分离的影响Retention of BTE

16、AC as a function of pH Atlantis silica 85% ACN-0.1M NH3 pH adjusted with formic acidACN0.1M HCOONH4, pH 8.210.2D.V. McCalley J. Chromatogr. A 1171（2007）46Analysis of test solutes on Atlantis silica亲水作用色谱影响因素及应用亲水作用色谱影响因素及应用柱温对亲水模式分离的影响aspirincytosineTSKgel Amide-80YMC-Pack NH2HILIC Silica ZIC-HILICA

17、CN/water: 90/10(10mM ammonium acetate)Y. Guo, J. Chromatogr. A 1074（2005）71亲水作用色谱影响因素及应用亲水作用色谱影响因素及应用亲水作用色谱应用血浆中叶酸化合物的检测Nest Group HILIC column，乙腈乙腈/ /水水（75：25）5mM乙酸铵乙酸铵，pH 6.9S.D.Garbis，Anal. Chem. 73（2001）5358亲水作用色谱影响因素及应用亲水作用色谱影响因素及应用单糖、寡糖分离单糖、二糖分离单糖、二糖分离 氰基柱氰基柱 乙腈乙腈/ /水水/ /甲酸铵甲酸铵 (240 mM, pH 3.0

18、) 76:23:1麦芽寡糖分离麦芽寡糖分离 氨基柱氨基柱 乙腈乙腈/ /水水/ /甲酸铵甲酸铵 (240 mM, pH 3.0) 70:29:1A. H. Que， Anal. Chem. 74（2004）5184 亲水作用色谱影响因素及应用亲水作用色谱影响因素及应用糖基磷脂酰肌醇锚蛋白（GPI-APs）分离（A）HILIC eluate；（B）PNGase F-treated HILIC eluateM. J. Omaetxebarria, Anal. Chem. 78 (2006) 3335亲水作用色谱影响因素及应用亲水作用色谱影响因素及应用MALDI-TOF mass spectra o

19、f peptides from MDP tryptic digest皂树皂苷分离（HILICHILIC-Q-TOF-MS模式）Y. Wang, J. Chromatogr. A, 1181 (2008) 51亲水作用色谱影响因素及应用亲水作用色谱影响因素及应用中药中强极性化合物的分离各种亲水色谱固定相用于中药水提样品的分离色谱柱固定相应用Atlantis HILICsilica甘草、葛根中黄酮类化合物的分离Venusil HILIC酰胺川芎、红花水提样品分离-CD环糊精枳实、黄芩水提样品，甘草、葛根中黄酮类化合物的分离川芎亲水指纹图谱研究 川芎样品预处理方法优化川芎样品预处理方法优化 方法学考

20、察方法学考察 川芎指纹图谱相似度评价川芎指纹图谱相似度评价中药中亲水化合物的分离中药中强极性化合物的分离 川芎样品预处理方法优化川芎样品预处理方法优化川芎水提液川芎水提液95%乙腈乙腈上清液上清液中等、弱极性中等、弱极性反相模式分离反相模式分离川芎指纹图谱川芎指纹图谱沉淀沉淀 70% 甲醇甲醇 醇溶液醇溶液强极性强极性亲水模式分离亲水模式分离川芎指纹图谱川芎指纹图谱中药中强极性化合物的分离川芎中等、弱极性成分反相模式分离（上图）；川芎中等、弱极性成分反相模式分离（上图）；强极性成分反相（中图）、亲水模式分离（下图），强极性成分反相（中图）、亲水模式分离（下图），UV检测检测（260nm）min

21、10203040mAU0204060801001110987654321川芎指纹图谱川芎指纹图谱min010203040mAU051015202512345678109川芎指纹图谱川芎指纹图谱min010203040mAU0100200300400500 方法学考察序号R.S.D .(%)精密度(n=5)重现性(n=5)稳定性(n=7)10.260.110.3720.220.070.3530.110.070.3340.110.050.3050.130.050.2760.090.050.2570.110.040.2080.090.040.1690.060.020.10100.050.020.10110.050.020.08序号R.S.D. (%)精密度(n=5)重现性(n=5)稳定性(n=7)10.690.240.6021.330.971.3831.351.071.3340.490.340.5650.540.720.4760.400.44