丙型肝炎病毒抗体的检测及其临床应用进展

1、丙型肝炎病毒抗体的检测及其临床应用进展    【摘要】：象其它传染病一样，丙型肝炎是社会医学工作者所面临的又一个重要课题：目前，全球约有2亿人感染丙肝，其中在发展中国家的感染率     【摘要】：象其它传染病一样，丙型肝炎是社会医学工作者所面临的又一个重要课题：目前，全球约有2亿人感染丙肝，其中在发展中国家的感染率、发病率尤高。美国疾病控制中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）在2000年的统计数据，美国有一万人死于丙肝感染；据估计，到2010年，丙肝的

2、死亡率将可能超过艾滋病。    19881989年，对引起非甲非乙型肝炎（Non-A and non-B hepatitis，NANBH）的病原体研究取得了突破性进展，从一患有慢性NANBH的黑猩猩外周血中分离得到的一种RNA病毒揭开了丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）的研究序幕；利用该段特异序列，表达了一个特异性克隆，并得到了一个可延长的融合蛋白（C100）。美国强生OCD公司（Ortho-Clinical Diagnostics，a Johnson & Johnson company）利用该蛋白作为包被抗原、以酶联免疫

3、吸附实验技术（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）为基础，研制出了最初的第一代商业性抗-HCV临床检测试剂；同时，OCD与其合作伙伴美国凯荣公司（Chiron Corporation）共同在全世界范围内享有抗-HCV检测的专利权。 近十几年来，OCD公司不断努力，先后又研制出了抗-HCV的ELISA二代、三代检测试剂并推向市场；随着这些高质量检测试剂的研制成功及其在献血员筛查中的广泛应用，世界范围内输血后HCV感染的发生率已经大大下降，从而为安全输血提供了可靠的保证。    一. 抗-HCV IgG检测 目前对

4、HCV抗体主要以检测IgG为主，所采用的均为间接法；IgM类抗体的检测主要用于一些临床研究。 1. 酶联免疫吸附实验（ELISA） 检测原理：ELISA检测抗-HCV IgG系利用固定在固相载体（如普通酶标板、聚苯乙烯试管及小球、磁性微粒子等）上的HCV重组表达和/或人工合成多肽抗原，捕捉待测样品中的抗-HCV IgG，然后，通过加入酶（辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶ALP等）标记的抗-人IgG检测所捕捉到的特异性抗-HCV IgG。重组、合成抗原的不同组合方式可能产生不同的检测结果，另外，由于样品中的其它IgG和固相载体之间的非特异性结合，也可能出现假阳性测定结果。 第一代试剂利用来自HC

5、V病毒基因组中的部分NS3和NS4区重组表达抗原（C100）作为固相包被进行检测；第二代试剂利用来自HCV基因组NS3区的C33C和部分NS4区的融合表达抗原（C200）、再加上C区的核心抗原C22-3作为固相包被进行检测；第三代试剂在第二代抗原的基础上，又加入了来自NS5区的重组表达抗原，另外，部分公司的产品中又引进了合成肽抗原（图1）。 临床意义：该方法目前被广泛用于献血员中的HCV感染筛查和临床实验室检测，抗-HCV检测阳性提示接触过病毒；对大部分病例而言，抗-HCV阳性常伴有病毒核酸HCV RNA的存在，因此，抗-HCV是判断HCV感染的一个重要标志。抗-HCV阳性而血清中没有HCV

6、RNA提示既往感染；在极少数病例中，没有抗-HCV仍可检测到HCV RNA。另外，某些慢性感染者的抗-HCV可持续存在。 第一代抗-HCV IgG试剂盒所应用的抗原来自病毒基因组非结构区（C100），用其对献血员进行筛查后，使输血后HCV的感染率下降了80%以上。但其缺陷主要是：灵敏度低，抗体检出时间较晚，且C100抗体有可能出现间歇性阳性；非特异性反应较高。第二代试剂除上述C100抗原外，又加入了HCV核心区多肽C22-3和非结构区抗原C33C。抗-C22-3和抗-C33C感染后出现较早，而且，核心区抗原C22-3与NS3区C33C抗原无论在早期诊断及灵敏度和特异性等方面均优于C100，以上

7、抗原联合应用可进一步提高检出率。第三代试剂比第二代试剂更灵敏、更特异，以OCD公司的抗-HCV ELISA检测试剂为例，其第一代、第二代、第三代试剂的“窗口期”（即HCV感染早期、抗体阴性而无法检出的时期）分别为平均150天、82天、70天。第三代试剂的改进主要在于：核心区抗原比例相对下降，而相应地增加了NS3区C33C的比例，优化了试剂盒的组装工艺；利用现代基因重组技术，对一些重要抗原采用更好的表达、纯化系统进行表达和纯化，对相应的基因片段进行了重新定位，利用各种先进的生产工艺，使包被抗原的免疫活性更强，从而提高了检测的灵敏度，减少了非特异性反应；加入了NS5区抗原。因此，第三代试剂不仅能更

8、早地发现HCV感染者，而且提高了低危人群（如无偿献血员）检测的特异性；随着第三代试剂的应用，抗-HCV假阳性结果已大大减少。 在抗-HCV的ELISA测定中，确定合适的Cut off值对减少假阳性、假阴性具有重要意义；Cut off值的上移或下移，可导致假阴性或假阳性结果的出现。Cut off值的确定就是要使依其得到的测定结果假阳性和假阴性发生率均为最低，也就是说，应找到一个最佳的“平衡点”，使假阴性和假阳性达到最佳平衡；而处于Cut off值附近的测定结果可归为可疑，亦即ELISA测定的“灰区”。    抗-HCV ELISA试剂所用抗原 &

9、#160;       结构区   非结构区    5'NCR C E1 E2 NS2 NS3 NS4 NS5 3'NCR         第一代         C100     第二代 C22-3   C200（C33C + C100） &

10、#160;  第三代 C22-3   C200（C33C + C100） NS5     2. 凝集实验 检测原理：凝集实验（Particle agglutination，PA）系利用HCV抗原所包被的乳胶等微粒子和待测血清进行反应、通过观察乳胶微粒体凝集现象的发生来反映待测样品中抗-HCV的有无。PA试剂价格低廉、检测中不需要特殊的仪器设备（目测即可判定结果），因此，适用于发展中国家抗-HCV在献血员中的大范围筛查；但灵敏度可能略低于ELISA。 临床意义：与ELISA实验相同。 3. 放射免疫实验 检测原理：与

11、ELISA实验基本相同，用HCV不同片段的重组表达抗原和/或合成多肽抗原包被固相载体，与待测样品中的抗-HCV反应后，加入放射性核素（如125I）标记的羊抗-人IgG，洗涤、去除未结合的放射性标记物后，通过计数器测定每份样品的cpm值。该方法操作复杂、存在放射性污染，需要配置特殊的计数器，因此，应用不十分普及。 临床意义：与ELISA实验相同。 4. 快速检测技术 检测原理：将HCV不同片段的抗原固化在硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜、尼龙膜等载体上，然后，应用免疫渗滤或免疫层析技术与待测血清进行反应、以酶（HRP、ALP等）或胶体金、胶体硒等标记的二抗作为示踪物检测抗-HCV的存在。该方法的反应时

12、间短（一般为十几分钟）、操作简便、不需要特殊的仪器设备、结果判断简单，也很方便单人份测定。因此，适用于急诊、口腔科室和乡村医疗机构等小型实验室对抗-HCV的检测；缺点是试剂价格略高，不适于批量样品的测定，而且，不同厂家试剂质量差异较大。 临床意义：与ELISA实验相同。 5. 其它检测技术 如荧光偏振免疫技术（Fluorescence polarization immunoassay，FPIA）、时间分辨免疫荧光技术（Time resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）、化学发光（Luminescent immunoassay，LIA）、增强化学发光（En

13、hanced chemiluminescence，EC）等。与ELISA技术的酶促发色反应相比，上述方法在特异性信号的产生方面有较大改进，如酶促发光（LIA、EC）、荧光激发（FPIA、TRFIA）等，通过这种改进，使检测的灵敏度和特异性得到进一步提高，目前以上技术大都采用封闭式全自动检测模式，比较适用于医院对临床病人样品的测定。 以OCD公司于20世纪90年代末期推出的全自动免疫分析系统ECi为例，ECi应用增强化学发光技术测定HCV抗体，实验过程如下：在HCV重组表达抗原包被的“子弹头”形小杯中，加入待测样品，经过37孵育，样品中的抗-HCV与固相包被抗原相结合，形成免疫复合物，经过洗涤，

14、将未参与反应的杂蛋白除去；第二步，加入HRP标记的二抗，37孵育，标记抗体与被固相所“捕获”的抗-HCV结合，并被固定在小杯的管壁上，洗涤去除游离的标记抗体；最后，加入氧化剂（过氧化氢H2O2）、化学发光增强剂（3-氯-4-羟基-乙酰苯胺，OCD公司专利）和发光剂（鲁米诺），这时，结合在固相上的HRP在H2O2的作用下，将增强剂3-氯-4-羟基-乙酰苯胺氧化成自由基，接着，诱导鲁米诺并使之活化、发光；由于增强剂可以反复循环活化，因此，鲁米诺能够连续发光，发光强度不断增加，从而使发光持续时间得以延长，便于测定，同时，检测的灵敏度也得到了显著提高。 临床意义：与ELISA实验相同。 6. 补充/确

15、认实验 检测原理：为了对ELISA筛查实验阳性的样品进行确认，Chiron公司又推出了相应的补充/确认实验重组免疫印迹实验（Recombinant immunoblot assay，RIBA），该实验是以待测血清中的HCV抗体和分别固定在硝酸纤维素膜载体上的不同HCV抗原之间的特异性结合反应为基础、通过再加入酶（一般为ALP）标记的二抗来确认样品中抗-HCV的存在和有无；目前，该项技术已经得到了美国食品及药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）的认可，成为HCV抗体确认的国际标准。因为HCV的各种抗原分别被单独固化在载体的不同位置上，因此，该项检测又可

16、以区分待测样品对HCV不同抗原的不同反应性。目前，RIBA HCV在全球由OCD公司供货及提供相关的技术服务。 临床意义：RIBA目前主要被用于ELISA筛查实验阳性样品的HCV抗体确认，RIBA实验阳性的患者中，大约75%80%为病毒血症（即HCV RNA阳性）；RIBA实验阳性而血清中没有HCV RNA时提示可能为既往感染者。少数病例中，抗-HCV的ELISA检测为阳性、RIBA实验单个抗原阳性，即RIBA检测结果为不确定（Indeterminate，IND），此时无法确定抗-HCV的感染情况；这种现象可能为HCV急性感染的早期或免疫力低下的患者，也可能为假阳性结果，因此，应依据不同病人的

17、临床情况、具体加以解释。另外，由于RIBA实验可以区分样品中的不同HCV抗体成份，因此，在探讨HCV不同片段抗体检出的临床意义方面也有重要作用（表1）。    表1 HCV各片段抗体检出的临床意义     抗体     临 床 意 义         C    HCV感染后出现很早，阳性率也很高；在抗-HCV检测中发挥重要作用  

18、0;  NS3    抗原的免疫原性很强，相应的抗体滴度也很高，HCV感染后出现很早，同C区抗体一样在抗-HCV的检测中发挥重要作用     NS4    HCV感染后出现延迟，持续阳性可能与疾病的慢性化有关     NS5    HCV感染后出现较早，可用于急性期感染的诊断     二. 抗-HCV IgM测定 检测原理：采用间接ELISA法，用基因工程表达的重组抗原或人工合成的HCV特异性寡肽抗原包被在微孔板内，加入待测血清，如果血清内含有抗-HCV IgM，则与之结合，洗板后再加入HRP标记的抗-人链F(ab')2片段，最后加底物显色。 临床意义：对于大多数传染性病原体而言，IgM型抗体的检出通常提示急性期感染，但目前对抗-HCV IgM在HC