骨髓基质干细胞的单克隆化培养和多向分化的实验研究

1、    作者：郑东，杨述华，冯勇，杨操，李进，梅荣成，唐欣，徐亮【摘要】  目的 通过对骨髓基质干细胞(marrow stromal cells，MSCs)的单克隆化培养、鉴定和扩增，获得从一个单细胞扩增出的大量均质MSCs，并研究其多向分化能力。方法 无菌条件下获取大鼠骨髓细胞，在培养的过程中挑出相应的单细胞克隆。将挑出的单细胞克隆与饲养细胞混合培养，快速进行扩增和细胞表面标志的鉴定，并进一步行增殖和细胞分化实验。结果 在含有特定饲养层细胞的培养条件下，单克隆来源的MSCs能在抑制分化的状态下大量扩增，并保持细胞的均质性；而且在这种

2、培养条件下，MSCs的增殖能力明显增强，并能成功被诱导向软骨、神经样细胞分化。结论 通过骨髓细胞的单克隆培养，获得了均质和多向分化潜能的MSCs，为进一步更精确的研究MSCs的生物学特性提供了基础。 【关键词】  骨髓基质干细胞骨髓基质干细胞(marrow stromal cells，MSCs)被认为是生物工程领域中最具潜力的一种种子细胞，在骨软骨组织工程和神经细胞等的修复中都具有广泛的应用，甚至还有研究表明MSCs还可以分化成肝细胞和胰岛样细胞1，2。但是我们对这种细胞本身的研究却不是很完善，本实验就是希望通过对单克隆来源的MSCs进行扩增和鉴定，获得大量均质单一细胞来源

3、的MSCs，并在此基础上进行单克隆来源的MSCs分化的初步实验研究，证明这种成体干细胞的分化和横向分化能力。1  材料和方法：1.1  试剂  胎牛血清FBS，胶原酶，透明质酸酶，DMEM，胰酶，Trizol reagent试剂盒购自Gibco公司；RT试剂盒，TaqDNA聚合酶为MBI公司的产品；TGF3购自RD公司；STRO1、CD34、CD45、OCT4、CD105、Nestin分别购自BioLegend和Serotec公司；丁羟基茴香醚，丝裂霉素分别购自武汉凌飞公司；其他生化试剂分别是国产和进口分析纯。1.2 

4、60;方法1.2.1  大鼠骨髓细胞的原代培养  取一月龄SD大鼠(同济医学院动物实验中心提供)，在无菌条件下取出大鼠的股骨，用完全培养基(20FBS，DMEM低糖，VitC 50 g/mL，青霉素100 U/mL，链霉素100 g/mL，两性霉素R 0.25 g/mL)分别冲洗骨髓腔，获得的细胞悬液充分打匀，然后用细胞筛网过滤，配成单细胞悬液，将该细胞悬液调整细胞浓度为1×103/mL后接种到培养板中。相差显微镜下观察细胞生长情况，并挑选单个细胞贴壁生长的区域，用笔做好标记。1.2.2  小鼠胚胎成纤维细胞(mouse e

5、mbryonic fibroblast，MEF)的获取和培养  在无菌条件下获取和分离胚龄为1周的小鼠胚胎，减去头、四肢和内脏，超净台中将胚胎组织剪成肉泥状，碎块大约为1 cm3。转移到离心管中，加入0.25的胰酶5 mL，37细胞培养箱消化10 min。取消化后的上清液，转入10 mL的离心管中，加入3 mL的完全培养基(FBS 10，DMEM低糖，VitC 50 g/mL，青霉素100 U/mL，链霉素100 g/mL，两性霉素R 0.25 g/mL)。余下的组织继续按照上述方法同样处理，消化过程进行45次。所获得的上清液一起转到一个50 mL的离心管中，1 000 r

6、/min，离心8 min，弃上清，将细胞重新悬浮于30 mL的完全培养基中，细胞筛网过滤，制成单细胞悬液，调整细胞浓度到2×104/mL，接种于培养瓶中。通过不断的培养传代获得足够的MEF后，再用10 mg/L的丝裂霉素进行处理获得mtMEFs(mitomycin treated mouse embryonic fibroblasts，mtMEFs)备用。1.2.3  原代骨髓细胞培养过程中，单克隆细胞的挑出、扩增和鉴定  将mtMEFs以1×103/mL接种到六孔板中。24 h后换液，除去未贴壁的细胞，备用。原代培养骨髓细胞生长到8

7、 d时，出现单克隆样生长，在显微镜下通过无菌的方式将克隆样生长的细胞挑出，具体方法如下：首先在单个细胞贴壁生长的区域确定较为独立的具有MSCs生长形态的单细胞克隆，在相差显微镜下用笔在瓶壁上做好标记，然后在显微镜下用消毒后蘸有0.25胰酶的小片滤纸将单克隆生长的细胞从局部消化，分别接种到载有饲养层细胞mtMEFs的六孔板中，继续培养。当细胞达到80融合后消化传代，转入培养瓶中进行培养，传到第4代后，将MSCs和新加入的mtMEFs按11混合后再继续培养(因为mtMEF没有增殖能力，mtMEFs传到第4代时细胞会损失殆尽，所以需要补充新的细胞)。如此循环，在培养的过程中不断的补充mtMEFs，直

8、到单克隆培养的MSCs总共传代数为20代(20 passage P20)，取P20 MSCs进行细胞表面标志(STRO1、CD34、CD45、OCT-4、CD105、Nestin)的流式鉴定。1.2.4  MSCs和mtMEFs的混合培养和增殖能力的测定  将经过鉴定的单克隆培养出P20的MSCs消化，取1×103的MSCs和1×103的mtMEFs按11比例混合后，接种到96孔板中；同时取常规培养的P3代MSCs，分离和培养方法参考Zheng D等3使用的方法，消化后取1×103接种到96孔板中；另外，将单纯mtMEFs消

9、化后取1×103个细胞接种到96孔板中，作为空白对照(不加MSCs)。通过MTT检测这三组细胞的增殖率，每组每次检测10个样本，结果经过统计学分析后绘制生长曲线。1.2.5  单克隆细胞来源的P20 MSCs成软骨能力的研究  将同样的P20 MSCs消化，取1×105个细胞加入15 mL的无菌离心管中，以1 000 r/min的速度离心10 min，待细胞沉淀形成细胞团块后，换用诱导培养基进行培养DMEM高糖，10 ng/mL TGF3，107 mol/mL地塞米松，50 g/mL VitC，40 g/mL脯胺酸，100 g/mL的

10、丙酮酸盐，50 mg/mL ITSPremix(6.25 g/mL的人类重组胰岛素和转铁蛋白，6.25 ng/mL的亚硒酸，1.25 mg/mL的牛血清白蛋白和5.35 g/mL的亚油酸)，分别于7、14、21、28 d取出培养的细胞团块，经过3 mg/mL胶原酶、1 mg/mL的透明质酸酶和0.25胰酶在37消化3 h后，提取总RNA，用RTPCR测定胶原2(COL)、COL和Aggrecan(Agc)的表达，引物：COL     上游：5GGCGAGTCTTGCGTCTACC 3     下游：5AGGCGTG

11、AGGTCTTCTGTGA 3(421 bp)；COL     上游：5CTAAAGGAGTGCCTGGAC 3     下游：5TCTTGGGTCATAGTGCTG 3(479 bp)-actin     上游：5GTAAAGACCTCTATGCCAACA 3     下游：5TAGAAGCATTTGCGGTGC 3(259 bp)Agc     上游：5GAATCCGAGACACCAACG 3

12、     下游：5TCCTCTTCACCACCCACT 3(406 bp)    同时，14、28 d时将培养的细胞团块取出，4甲醛固定6 h后，石蜡包埋，用甲苯胺蓝测定软骨基质中蛋白聚糖(proteoglycan)的表达。1.2.6  单克隆细胞来源的P20 MSCs向神经样细胞分化能力的研究  取相同的单克隆来源的P20 MSCs进行消化，取1×104个细胞接种于培养瓶中，24 h贴壁后换用诱导培养基，首先用预诱导培养基(DMEM，20FBS，1 mmol/mL巯基乙醇)培养24

13、h，然后用诱导培养基(DMEM，2二甲基亚砜(DMSO)，200 mol/mL丁羟基茴香醚(BHA)继续培养。之后每3天换一次液，第1、3、6天分别在相差显微镜下观察细胞生长形态。第6天，将细胞用4多聚甲醛固定，之后用免疫荧光方法对细胞分化后表达的NSE进行鉴定。2  结    果a)原代培养的骨髓细胞第3天开始出现细胞的增殖现象，第7天单细胞开始出现孤立克隆样生长(见图1)，克隆周围的细胞呈旋涡状排列。b)原代培养的MEFs，第3天贴壁细胞伸展呈梭形，细胞增殖现象明显，待细胞扩增到一定数目后，用丝裂霉素进图1  略行处理，使MEFs

14、失去增殖的能力。c)与饲养层细胞混合培养的骨髓细胞，第5天开始出现明显细胞克隆样增殖。第8天细胞大量增殖，增殖的细胞顺着饲养层细胞的表面向周围延伸，在饲养层细胞的间隙迅速贴壁生长(见图2)。图2  图3  略    d)P20单克隆来源的MSCs其表面标记的鉴定结果(见图3)。在流式细胞表面标志的鉴定中，STRO-1、OCT-4-，CD-34-、CD45-和CD105、Nestin-，的细胞分别占总细胞的96.56、99.03、99.96。而OCT-4、STRO-1，CD-34、CD45和CD105、Nestin的细胞仅占0.02、0

15、.04和0。因此通过这种单克隆培养方式能获得大量高纯度的未分化MSCs，因为培养的细胞是单克隆来源，是均质的，这些单克隆来源的细胞应不含胚胎、造血和神经干细胞。e)三组细胞进行MTT测定，获得的数据绘制生长曲线(见图4-A)，随着时间的增加，P3 MSCs和混合培养的细胞(P20 MSCs和mtMEFs)，在第35天都出现了明显的增殖，但混合培养细胞的增殖率明显高于P3 MSCs组，mtMEFs培养组由于其没有增殖能力，MTT测定OD值逐渐下降。在P20 MSCs和mtMEFs混合培养组的基础上剔除mtMEFs影响后绘制生长曲线图(见图4-B)，可见在从第3天开始混合培养中的P20 MSCs的

16、实际增殖率就开始高于P3 MSCs组，而且随后增高的比率更加明显，第5天出现了明显的G0期，随后又进入增殖期。与对应的P3 MSCs相比，单克隆来源的P20 MSCs的细胞周期显得更加一致，G0期更短，细胞增殖率更高，结果有显著性差异。图4图6  略    f)单克隆来源的P20 MSCs在向软骨的诱导分化过程中，第7、14、21、28天胶原的表达的情况(见图5)，可见在诱导的过程中COL、和Aggrecan表达的量不断增加。14和28 d时细胞基质外的蛋白聚糖通过甲苯胺蓝的染色，含量亦明显增加。g)单克隆来源的P20 MSCs在向神经样细胞的诱导分化过

17、程中，细胞的形态逐渐变成多角形，有轴突的现象生成(见图6-A)。经过NSE染色，在荧光显微镜下，可见诱导分化的细胞有相应的染色(见图6-B)。3  讨    论国内外的研究表明，MSCs是最具研究潜力的一种组织工程的种子细胞。首先，因为其是一种成体干细胞，因此做为组织工程的种子细胞就避免了伦理学上的问题；其次，MSCs虽然是一种成体干细胞，但有大量研究表明这种成体干细胞有着巨大的多向分化潜能，令人更感兴趣的是，它不但能向中胚层的各种细胞分化，比如骨、软骨等，还能向外胚层的神经细胞进行分化，甚至还可以向内胚层的消化和内分泌细胞分化，比如肝细胞和胰岛样细胞，

18、这就是所谓的MSCs的“横向分化能力”；最后，MSCs获取容易，相对于大多数成体干细胞，MSCs可以很“容易”地大量获取4。尽管如此，在MSCs的研究中还存在着许多问题，其中一个关键的问题就是在绝大部分实验中，我们获取的MSCs都是一种混合的细胞群，还缺乏明确获得完全均质和单一的MSCs的方法，而这个问题直接导致我们无法更精确的研究MSCs的生物学性状5。另外在MSCs的“横向分化能力上”，同样是因为现有实验中培养的MSCs是一群细胞的混合体，所以除向中胚层分化的在学术界得到肯定外，向其他胚层细胞的分化，即“横向分化能力”仍然缺乏直接的证据。部分学者认为这些横向分化的能力来源于骨髓中其他的成体

19、干细胞或胚胎干细胞或不同的成体干细胞相互融合所致6，而MSCs本身并不存在“横向分化能力”。本实验通过培养和扩增单克隆来源MSCs，获得理论上完全均质的MSCs，为解决上述问题提供了实验基础。在本实验中，我们需要将获取的数量极少的单克隆来源的MSCs扩增成大量的可供实验的MSCs，在这个过程中如何能保持MSCs的未分化特性和快速的增殖能力就成了亟待解决的问题，为了解决这个问题，我们在培养的过程中使用较低密度的饲养层细胞mtMEFs，国外有学者使用过类似的方法培养成体干细胞7。mtMEFs能分泌有效促进MSCs增殖的FGF2和抑制MSCs分化的LIF8，而且经过丝裂霉素处理过的mtMEFs丧失了

20、增殖能力，混合培养45代之后，mtMEFs就会完全消失而获得单一的单克隆来源的MSCs。未单独使用FGF2和LIF代替饲养层细胞培养单克隆来源的MSCs的原因是：我们认为除了以上两种主要的细胞因子之外，挑取的单克隆细胞从少数几个细胞开始扩增成大量细胞时，还需要周围细胞的支持形成一个有效的微环境9。待挑取的单克隆细胞扩增到一定数目后，我们对其进行了表面标记的鉴定，结果表面标记鉴定的结果符合MSCs。在鉴定出单克隆来源的MSCs后，我们进行了细胞增殖和初步的分化实验。我们发现在MSCs和mtMEFs的混合培养过程中，单克隆来源P20 MSCs增殖速度要明显快于常规培养P3 MSCs，这为大量获得这

21、种均质的MSCs提供了基础；在分化实验中，这种单克隆来源的MSCs不仅成功向软骨分化，还分化出了神经样细胞，因为这种MSCs是单克隆来源的，所以也为MSCs的“横向分化能力”提供较为直接的证据。在今后的研究中，一方面我们需要进一步研究这些经过初步鉴定的单克隆来源MSCs可能有的更细致的差别，另一方面，全面的研究这种单克隆来源的MSCs向其他组织细胞分化的“横向分化能力”，例如肝细胞，胰岛样细胞等。【参考文献】  1 Forte G，Minieri M.Hepatocyte growth factor effects on mesenchymal stem cells：pro

22、liferation，migration，and differentiationJ.Stem Cells，2006，24(1)：2333.12 Chen LB，Jiang XB.Differentiation of rat marrow mesenchymal stem cells into pancreatic islet beta-cellsJ.World J Gastroenterol，2004，10(20)：30163020.13 Zheng D，Yang S.Experimental study on allogenic decalcified bone matrix as carrier for bone tissue engineeringJ.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2004，24(2)：147150.14 Kassem M.Mesenchymal stem cells：biological characteristics and potential clinical applicationsJ.Cloning Stem Cells，2004，6(4)：369374.15 Beyer Na