原发性胆汁性肝硬化特征性自身抗体研究进展-论文

1、518临床检验杂志 (电子版 2014年 3月第 3卷第 1期 Clinical Laboratory Journal(ElectronicEdition , Vol.3, No.1, Mar ,2014论 著原发性胆汁性肝硬化特征性自身抗体研究进展谭延国,闫惠平,高祖华 1 谭延国,在读博士,副教授,首都医科大学附属复兴医院检验科副主任,主要从事 临床免疫学检验和实验诊断学相关研究。摘要 原发性胆汁性肝硬化(PBC 是不明原因导致的肝内小胆管的进行性破坏,最后可导致肝硬化、 肝衰竭。 AMA(抗线粒体抗体 在 PBC 的诊断中具有独特的地位, 是疾病诊断标志之一。 但是, PBC 中尚有 1

2、0%左右的个体 AMA 阴性,在这部分人群中,有将近半数具有特征性抗核抗体的检出。本文 就 PBC 具有疾病特征性的自身抗体与 PBC 的关系作一综述。关键词 原发性胆汁性肝硬化;自身抗体;线粒体抗体; Sp100; gp210中图分类号R446.62文献标志码A文章编号2095-2775(2014 01-0518-06Pr ogr ess of the r ela tionship between cha ra cter istic autoantibodies a nd primar y bilia ry cirr hosisAbstractPrimary biliary cirrhosi

3、s is a chronic disease with progressive destruction of intrahepatic bileducts by unknown etiology. The ultimate clinical outcome of PBC is liver cirrhosis and failure. Anti-mitochondrial antibody (AMAisunique in the diagnosis of PBC, because it is one of the criterion of the disease. There are aroun

4、d 10%PBC patients whose AMAs are negative, and among those patients, about a half are positive for specific anti-nuclear antibodies. We review the latest advances on the relationship between characteristic antibodies and PBC in this article.Keywor dsprimary biliary cirrhosis; autoantibodies; anti-mi

5、tochondrial antibodies; Sp100; gp210基金项目 基金资助:首都卫生发展专项基金 (2011-2018-05作者简介 谭延国,在读博士,主任检验技师。主要从事检验医学和实验诊断学研究 作者单位 100038北京首都医科大学附属复兴医院检验科 (谭延国 ; 100069北京首都医科大学附属北京佑安医院感染与免疫研究中心(闫惠平 ; 100069北京首都医科大学附属北京佑安医院病理科(高祖华通讯作者 闫惠平:y 536。高祖华:z 原 发 性 胆 汁 性 肝 硬 化 (primary biliary cirrhosis , PBC 是自身免疫性肝病中最为常见的 一种

6、胆汁淤积性肝脏疾患,以中年女性好发,慢 性、进程缓慢,最终发展为肝硬化、肝衰竭、需 要肝移植 1。 在大于 40岁的女性之中, 该病发病 率估计为 1/10002。与大多数自身免疫疾病类似, PBC 的发病机 制尚不明确,环境因素作用于遗传易感性个体是 重要的原因之一 3。 T 细胞介导的细胞免疫据报 道在 PBC 的发病机制中发挥了主要作用, 而陆续的研究成果显示 B 细胞介导的体液免疫在其中也 扮演了重要的角色,逐渐引起关注。而且使用最 先进的检测方法,抗线粒体抗体及其 M2亚型抗 体(AMA-M2可以在将近 95%的 PBC 患者检 测出来, 是最直接并具有高度特异性的自身免疫 标志物,

7、 为国际公认诊断标志之一。 但遗憾的是, 至今尚未证实 AMA 与 PBC 的发生和临床进程具 有相关性,以及血清 AMA 阳性的动物模型并非 总是发展为 PBC 样肝损伤, AMA 在 PBC 的免疫 病理和发病机制中所起的作用仍是不清楚的。 虽hp u-hua.gao mcgill.ca临床检验杂志 (电子版 2014年 3月第 3卷第 1期 Cli nical Laboratory Journal(Electronic Edition , Vol.3, No.1, Mar , 2014519然多数研究支持在观察期间 AMA 水平不受治疗 的影响的观点 4,但由于 AMA-M2在 PBC

8、诊断 中的独特地位, 以及 AMA-M2阴性的 PBC 患者 的存在, 对 AMA 以及其他 PBC 特异性自身抗体 进行深入的认识和探讨便显得尤为必要。因此, 本文就此问题作一综述。1PBC 相关的自身抗体及其靶抗原自身抗体的检出是发现和正确诊断 PBC 的 重要手段之一,因 PBC 患者也可以与干燥综合 征(SS 、自身免疫性甲状腺炎、类风湿性关节 炎、乳糜泻等自身免疫性疾病并存, 12%20%的 PBC 患者有自身免疫性肝炎 (AIH 的特征 5。 所以 PBC 中检测自身抗体具有重要的诊断和鉴 别诊断意义。Berg 等发现, 多数 PBC 特异性的 AMA 在 体外能够结合到胰蛋白酶敏

9、感的线粒体内膜的 抗原上, 这些抗原可以用 FOF1-ATPase 从所有被 测试的器官、 甚至包含真菌共纯化而来。 由于心 磷 脂(梅毒 相关 的线 粒体 抗原 已 被命 名为 AMA-M1,这些抗原此后被命名为 AMA-M2。 这个小组确定了一套 AMA 靶抗原分类体系, 包 括 M1-M9。同 M2类似, M4(亚硫酸盐氧化酶 、 M8(未被鉴定的胰蛋白酶敏感抗原以及 M9 (糖原磷酸化酶也可以特异性的同 PBC 血清 结合。 Berg 后来鉴定了 M4抗原, 证明为丙酮酸 脱氢酶复合体的一个亚单位 PDC-E16,最近又 鉴定出 FOF1-ATPase 亚 单位为 AMA 的 靶抗原

10、8。除了 M2外,从独立研究机构得到的结果未 能够展示其他抗原的任何诊断相关性 7。在 AMA 及其靶抗原的性质得以 阐明的同 时,另外三个 PBC 相关的抗核抗体(ANA 荧 光模型被鉴定出来:细胞核多点型、 核膜型和着 丝点型。 细胞核多点型所对应的靶抗原是 Sp100、 Sp140、 PML(早幼粒细胞白血病核体蛋白,但 在绝大多数组织都存在 、 NDP52以及 SUMO (小 的泛素样调控制子 ;而细胞核核膜型抗体则针 对的是 gp210和 nucleoporin p62(核孔蛋白 p62 抗原。 这两种 ANA 类型都能在至少 30%的 PBC 患者中发现,并且显示了很强的疾病特异性

11、 7。 在缺乏 AMA 、 而临床又高度怀疑 PBC 时, 它们 的出现可用作 PBC 的辅助诊断。尽管 Sp100被 认为是 PBC 特异性的,但于 AIH (自身免疫性 肝炎 、系统性红斑狼疮(SLE 、干燥综合征等 疾病也可检出。 gp210和着丝点型抗体可在肝衰 竭和门脉高压患者中较多出现 4。部分 PBC 患者有可能重叠其他自身免疫性 肝病(AILD ,如 AIH 或原发性硬化性胆管炎 (PSC ,称为自身免疫性肝病重叠综合征。常 规血清学检查还可以检测其他的自身抗体 9。参 照国际自身免疫性肝炎小组(IAIHG 发布的评 分系统,以及由美国肝病研究会(AASLD 发 布的关于 AI

12、H 的建议,同 AIH 特别相关的自身 抗体有助于 AILD 患者诊断分类。 如抗 -肌动蛋白 (anti-F-actin 、 抗 -肝 肾 微 粒 体 -1型 (anti-LKM-1 、抗 -肝细胞溶质抗原(anti-LC1 以及抗 -可溶性肝抗原 (anti-SLA 等。 PBC 患者 检测到以上自身抗体是很强烈地提示其有重叠 AIH 的可能性。 不过,文献也有报道 AMA 在将 近 5%的 AIH 患者存在, 而这些 AIH 患者并无其 他胆道异常的特征。 抗平滑肌抗体 (SMA 能够 以很大比例存在于 PBC 患者, p-ANCA 不仅存 在 于 PSC , 而且也 以一定 比例存 在

13、于 PBC 和 AIH 。需要强调的是,重叠综合征必须结合临床 和其他生化、 免疫及病理特点做出诊断,临床和 组织学的真正重叠是很少见的, 很难定义, 而且 重叠综合征与单一疾病的治疗方式也是不同的 10。2AMA-M22.1AMA-M2的靶抗原AMA-M2的靶抗原于 20世纪 80年代被鉴 定为 2-氧酸脱氢酶复合体的组份, 这些酶催化酮 酸的氧化脱羧,都参与了线粒体生物产能过程。 采用 Western blot 方法可以发现它具有 5个靶抗 原的条带:M2a (70-74kDa 、 M2b (56kDa 、 M2c (45-48kDa 、 M2d (36-41kDa 、 M2e (31-3

14、6kDa 。 M2a 是主要的靶抗原,被鉴定为 丙酮酸脱氢酶的 74kDa 的 E2亚单位 (PDC-E2 。 随后的研究显示, 其余的靶抗原为 PDC 的 E3结 合蛋白 (E3BP-即 PDC-X (M2b 、 2-酮戊二酸脱 氢 酶 复 合 体 (2-oxoglutarate dehydrogenase complex, OGDC 的 E2亚单位、支链 2氧酸脱 氢 酶 复 合 体 (branched-chain 2-oxoacid dehydrogenase complex, BCOADC, M2c 以 及520临床检验杂志 (电子版 2014年 3月第 3卷第 1期 Clinical

15、 Laboratory Journal(ElectronicEdition , Vol.3, No.1, Mar , 2014PDC-E1和 E1亚单位 (M2d, e 。 而且 BCOADC 的 E1亚单位也被报道为 PBC 患者自身抗体的 靶抗原。2.2AMA-M2对靶抗原的识别Anti-M2识别所有三种 2-氧酸脱氢酶复合体 中高度保守的与硫辛酰基(lipoyl 结合的 E2亚 单位, 较低程度的与 E1和 E3亚单位结合。 连接 到 AMA 表位上的硫辛酸残基对抗体的结合是必 须的 11。 高达 90%的 anti-M2直接指向 PDC-E2、 而 50%的 同 OGDC-E2和 BC

16、OADC-E2、 同 PDC-E1和 PDC-E1发生反应的概率更小。 同时 结合到三种 E2亚单位的只见于少于 50%的 PBC 患者。更有趣的是,组织学证实的 PBC 病例, 有 4%13%只与 BCOADC 或 OGDC 反应, 而不 与 PDC-E2反应 。所有 的与 PDC-E2起反应 的 PBC 血清, 显示出同 PDC-E3结合蛋白有明显的 交叉反应。 几个关于 PDC-E2的研究已经绘制出 了主要的抗原表位区域, 指向了内部的硫辛酸结 合区域 -E2亚单位最保守的部分以及活性中心。 来自 PBC 患者的、 PDC-E2特异性的 anti-M2, 在体外能够抑制 PDC-E2的酶

17、活性。 一些 PDC-E2的外部区域也是一些病例自身抗体指向的靶位。 表 1和表 2为 PBC 常见的特异性抗体及其对应 的靶抗原。表 1PBC 常见自身抗体的靶抗原和抗体 3PBC 患者中特征性抗体对应的靶抗原线粒体抗原 (>95%2-OADC-E2亚单位 PDC-E2 OGDC-E2 B COADC-E2 PDC E3BPPDC-E1细胞核抗原(50% 核孔复合体 Gp210Nucleoporin62多核点 Sp100PML cells 表 2PBC 中 ANA 的常见类型及检出率在 AMA 阳性 PBC 中的检出率 (% 在 AMA 阴性 PBC 中的检出率 (%ANA 阳性 47

18、-4868-85多核点 12-2438-41核 膜型 (perinuclear/rimlikemembranous 6-1431-50斑点型(speckled 2441-46着丝点抗体 14-2014-23Anti-Sp10024-3138-54Anti-gp21016-1815-45注 :BCOADC, branched-chain 2-oxo-acid dehydrogenase complex; E3BP, E3-binding prot ein;gp210, glycoprotei n 210; OGDC, oxoglutarate dehydrogenase complex; s p

19、100, nuclear body speckl ed 100kDa; PDC, pyruvate dehydrogenas e complex; PML, promyelocytic leukemia;2-OADC, 2-oxo-acid dehydrogenase complex 。临床检验杂志 (电子版 2014年 3月第 3卷第 1期 Cli nical Laboratory Journal(Electronic Edition , Vol.3, No.1, Mar , 20145212.3AMA-M2的临床意义高滴 度的 IgG 型 anti-M2约 在 90%的 PBC 患者中被发

20、现,具有 PBC 的确定诊断价值,但 同 PBC 的进展或疾病分期的相关性报道不一 12; Anti-M2可以在明显的临床症状出现前几年便可 被检测出来,并且被视为 PBC 发展的预测指标 12。在一些 报道中, IgA 型和 IgG3型 anti-M2被描述为或者同组织破坏或疾病进程的严重程 度相关。然而无论 IgA 型和 IgG3型、以及 IgM 型 AMA , 鉴于 PBC 被临床认识的局限性, 该自 身抗体在临床实验室一般未视为常规检测项目。 AMA-M2抗体检测有助于 PBC 的早期发现 或预警。最初并无胆汁淤积性肝病的 AMA-M2阳性个体,大多数随着时间的推移发展为 PBC 的纵

21、向研究也表明, 这些自身抗体的确对发展演 化 为 PBC 是 很早 期的、 很特 异性 的指 标 1。 AMA-M2同病理生理的关联性仍不清楚 13,因 为这些抗体在正常人群有将近 1%的流行率,而 PBC 在世界 各地的流行率仅为 <0.1%。而且, AMA 将很典型的重现于经过移植的 PBC 患者, 但仅有少数个体有重新出现的 PBC 组织学特征。 对 大样 本的 无症 状的 、没 有初 始胆 汁淤 积的 AMA-M2阳性个体的前瞻性研究将是有提示作 用的, 患者需要被随访二十或三十年, 但尚无此 类研究。3PBC 的自身抗体与疾病AMA 及 PBC 有关的 ANA 等自身抗体的发

22、现,使 PBC 的早期诊断成为可能。因此,在许 多情况下, 血清学阳性有助于 UDCA (熊去氧胆 酸的及时使用。在 PBC 的早期阶段, UDCA 保护处于炎症状态的胆管细胞不受胆酸的毒性 作用, 以及恢复肝细胞分泌功能, 导致非移植患 者生存期的延长。在临床怀疑 PBC 的情况下, 准确和及时的自身抗体检测是至关重要的。 自身抗体阳性高度的诊断价值已经被两个 共识所强调,即美国肝病研究协会(AASLD 和欧洲肝病研究会(EASL 14。疾病相关的自 身抗体、 更特异的 AMA , 是确定诊断 PBC 的三 个标准之一。 当然在 AMA 阴性的情况下临床怀 疑 PBC 也是可能的,此时要综合

23、考虑其他两个 标准:即反应胆汁淤积的酶(ALP 和肝脏组织 病理学诊断。由于常规检查中被诊断为 PBC 患者数量的 增多,而且 PBC 的诊断绝大多数受自身抗体检 测结果的支持,所以自身抗体对诊断 PBC 的重 要性显得更为突出。 总之,患者通常具有胆管上 皮细胞破坏所致较高水平的胆固醇、 碱性磷酸酶 (ALP 、以及-谷氨酰转移酶(-GT ,也伴有 多克隆 B 细胞激活导致的 IgM 增高。自身抗体 血清学阳性和胆汁瘀滞的证据而不是肝细胞破 坏 (AST<5倍上限 ,提示 PBC 而不是 AIH 或药 物诱导的肝炎。 PBC 患者经常出现非特异的症 状, 如瘙痒和疲劳,由于以上原因,患

24、者经常到 皮肤科、内分泌、神经科或风湿科首先就诊。 需 要注意的是:AMA-M2在急性肝衰竭和药物诱 导的胆汁淤积病例中也可被检出, 但通常是短暂 的,然而其 AMA 的存在具有重要的诊断价值、 临床和致病意义。 AMA 在后者人群中的解释应 该根据临床特点和个体关键的临床病史综合考 虑 15-16。4PBC 相关自身抗体的检测技术和试剂最古老的方法检测 AMA 是补体结合试验, 这只是一个适度可重复性的试验, 已被其它现代 技 术 取 代 。 间 接 免 疫 荧 光 法 (indirect immunofluorescence, IIF 检测 AMA 基本 依据 Deborah Doniac

25、h 等于 1960年建立的方法进行, 使用富含线粒体的组织切片, 如肝脏、 肾脏和胃 组织作为检测基质。 IIF 被认为是检测 AMA 和 其它 AILD 相关的抗体首选的方法。 当由经验丰 富 的 专 家 进 行 实 验 操 作 时 , 其 敏 感 度 达 到 75%95%。AMA 阳性表现为明亮一致的颗粒性细胞质 荧光,主要是远端肾小管上皮细胞、胃壁细胞、 以及心 肌细胞。近些年, Hep-2细胞这种检 测 ANA 的标准基质, 也被用来检测 AMA 。 但为了 恰当的区分 PBC 出现的 AMA 与 ANA ,平行使 用 Hep-2细胞和啮齿类组织是更好的。 同其他技 术相比, IIF

26、法可以同时测定多种自身抗体,协 助 AILD 的鉴别诊断。 然而 IIF 也有一定局限性, 例如, 需要有经验的专家观察组织细胞中的荧光 模式, 费时费力,也容易产生个体间判读误差或 错误,如将 anti-LKM-1误判为 AMA 。当 2-氧酸脱氢酶复合体作为 AMA-2的靶抗 原确定以后, 开发一系列的固相检测方法已成为522临床检验杂志 (电子版 2014年 3月第 3卷第 1期 Clinical Laboratory Journal(ElectronicEdition , Vol.3, No.1, Mar , 2014可能。如微量滴定板 ELISA 、膜 ELISA (如斑点 法或条带

27、法 、以及以荧光珠为基础的试验方法 17,能达到 95%的敏感性,和 >98%的特异性。 这些方法已经和正在被开发为商用试剂盒广泛 使用。 这些商用试剂盒可能使用来自猪或牛心的 PDC 、 或重组表达的人 E2亚单位的混合物、 包括 所 有 三 种 E2亚 单 位 的 最 新 的 抗 原 (designer antigens 、或者由纯化的 PDC-E2和三种 E2重组 抗 原 的 混 合 物 构 成 的 检 测 系 统 (anti-M2-3E ELISA 18。通常,使用纯化抗原的方法,其敏 感性可以达到 85%,而得分最高的检测方法为使 用最新的包含三种 E2亚单位的抗原(MIT3

28、。 然 而 仅 依 赖 重 组 的 E2抗 原 亚 单 位 或 者 designer antigens 可能 导致 假阴性 ,它 们没能 考虑 针对 PDC-E1亚单位的抗体 19。 anti-M2-3E ELISA 可 能达到 93.6%的诊断敏感性,而 MIT3ELISA 、 纯 化 PDC ELISA 、 IIF 法则 敏感性分 别为 91.3%、 83.8%和 87.3%,而特异性都能达到 98.8%。使用 免疫印迹技术显示, anti-M2-3E ELISA 阳性而与 纯化 PDC 不反应的血清,可以识别其他两种 2-氧 酸脱氢酶复合物的重组的 E2亚单位; 而且那些同 MIT3无反

29、应的血清则可能与 PDC 亚单位 E1或 E1起反应。最近有些厂商又开发出组合的检测方法, 联 合使用 PBC 相关的 ANA 靶抗原、 AIH 相关的自 身抗原、 2-氧 -酸脱氢酶复合体等作为检测抗原。 这些检测试剂盒或者被用作多特异性微量反应 板 ELISA 的过筛试验, 用于协同检测 anti-Sp100, anti-gp210以及 AMA 20(总体的敏感性为 83.8%, 特异性为 94.7% 。或者使用多参数的膜 ELISA 法 , 可 以 同 时 检 测 PBC 特 异 性 的 抗 体 , 如 AMA-M2、 anti-Sp100、 anti-gp210,以及 AIH 特 异的

30、自身抗体如 anti-SLA , anti-LKM1, anti-LC1以及其他参数。 这些多参数检测方法的诊断效能 已经被单个或多中心的研究所评估, 报告称多参 数测定总体上使 PBC 相关的抗体更加容易的被 检测出来。另外,还有用线粒体提取物或纯化的 PDC 为基础的 Western blot 方法,这些方法主要是为 了检测个体 AMA 的抗原特异性,或者为了某些 研究的特殊目的。5临床实践中 PBC 患者自身抗体检测的策略 间接免疫荧光法(IIF 目前公认仍是检测 ANA 、 AMA 等自身抗体的首选方法,是自身抗 体的初筛试验, 也可以检测多种 AILD 相关的自 身抗体,在临床实验室

31、被广泛使用。因为 IIF 可 以联合其他的组织底物 (肾、 胃、 肝 以及 HEp-2细胞, 以及人类乙醇固定的中性粒细胞,在多数 情况下, 可以准确的鉴定 AMA 、 ASMA , ANCA 等 AILD 相关的特异性指标,可以由 ANA 特征 性荧光模式发现对 PBC 具有诊断价值的自身抗 体。但仅仅采用 IIF 法,可能有少数 PBC 患者 AMA 阴性。 如果同时使用包含三种 E2抗原的新 型抗原分析系统平行检测 AMA ,可以显著地减 少所谓的血清学阴性的 PBC 病例。最近的研究 显示, E2designer antigen 在 ELISA 中的使用将 PBC 中 AMA 阴性的比

32、例降低到 7%,而 IIF 中 这一比例可能为 13%。以往有研究把 AMA 及 anti-M2阴性、血清 ANA 高滴度阳性的 PBC 称为自身免疫性胆管炎 (autoimmunecholangitis , AIC ,但 研究显 示, AIC 并不是一类有别于 PBC 而单独的疾病,虽 然其 ALP 、总胆红素、总胆固醇和血清 IgM 水 平比 AMA-M2阳性患者水平低,但其平滑肌抗 体阳性率更高。 免疫印迹法检测 AMA-M2发现, AIC 患者 IgA 、 IgM 、或 IgA 和 IgM 阳性患者分 别检出 13%、 17%和 22%。而 IgG 类 anti-M2在 所有 PBC

33、中均检出, 且 48%的 AIC 患者也阳性。 而组织学显示其多为早期阶段的 PBC (78% , 所以对于某些患者,为了检出 anti-M2,可以使 用免疫 印迹法同时检测 IgM 、 IgG 和 IgA 型的 anti-M2抗体 21。此外,在 PBC 血清学检查中,还需要包含 以 下 同 自 身 免 疫 肝 病 相 关 的 自 身 抗 体 : anti-Sp100、 anti-PML 和 anti-gp210, anti-SLA 以 及 anti-LC-1。 免疫印迹法检测自身抗体虽然敏感 性较低, 某些自身抗体检测结果与其他方法比较 有一定误差, 但其具有操作简便、 经济实用等优 点,

34、 依然有广泛的使用空间。 如果以上针对 PBC 的抗体均为阴性,当没有 PBC 组织学特征同临 床相符时, PBC 诊断可以被排除。 需要寻找其他胆汁淤积的潜在原因。 如果所有的自身抗体结果 都是阴性,但有胆汁淤积的证据,并符合 PBC临床检验杂志 (电子版 2014 年 3 月第 3 卷第 1 期 Cli nical Laboratory Journal(El ectronic Edition， Vol.3， No.1 ，Mar ，2014 523 的组织学特征，也应考虑 PBC， 可进行相应的治 疗以观察进展。总之，实验室应针对自身抗体检 测的特征性科学合理地选择检测方法， 实验室应 该报

35、告检测 AMA 和 ANA 的方法学，以利于临 床医师正确的评估检验结果。 【参考文献】 1 Bogdanos DP, Komorowski L. Disease-specific aut oanti bodies in primary biliary cirrhosis. Cl in Chim Acta. 2011, 412(7-8: 502-512. 2 Lindor KD, Gershwi n ME, Poupon R, et al. Primary bili ary cirrhosis. Hepatology, 2009, 50(1: 291-308. 3 Hirschfield GM

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