聚合酶链反应

1、火菌双蒸水30卩110X扩增缓冲液10卩14种dNTP混合物，每种浓度为L 16 卩1引物15 卩 1(100 pmol)引物25 卩 l(100pmol)模板DNA2卩1加火菌双蒸水至终体积100卩1置94C加热5分钟；将卩I Taq DNA聚合酶(5iu/卩I)加入反应混合液中；将1001轻矿物油加入混合液表面，以防水分蒸发；按所设定的反应条件进行循环反应(在 PCR仪上进行)； 反应终止后，取样品进行凝胶电泳，Southern杂交或DNA序列分析以鉴定 是否得到特异的扩增产物。衍生技术 PCR可扩增双链DNA和单链DNA并能以RNA为模板，进行反转录PCR 以扩增cDNA经不断发展和完善

2、，已有多种衍生 PCR技术。除反转录PCR#, 尚有不对称PCR反向PCR锚定PCR多重PCR着色互补PCR免疫PCR和套 式PCR等。(1) 反转录 PCR(reverse transcriptionPCR RT- PCR) RT PCF用于扩增 RNA样品。在PCF体系中先引入反转录酶，将 RNA反转录获得cDNA再以cDNA做为 PCR的模板，加入引物和Taq DNA聚合酶按正常PCR方式扩增cDNA。这一技术 广泛应用于RNA和RNA病毒的检测。(2) 锚定PCR(Anchored PCR)通常进行的PCR试验必须知道欲扩增 DNA或 RNA 片段两侧的序列，并以此为依据设计引物进行P

3、CR当欲扩增的片段序列未知时， 可通过锚定PCRi行扩增。其基本方法是分离细胞总 RNA或 mRNA并经反转录合 成cDNA通过DNA末端转移酶在cDNA3'端加上同源多聚物poly(dG)尾，通过 与其互补的锚定引物poly(dC)来保证扩增反应的特异性。反向PCR(Inverse PCR)常规PCR是扩增两个已知序列之间的 DNA片段， 反向PCR则用于扩增位于已知序列两侧的一段未知序列。 方法是使含已知序列和 未知序列的DNA片段环化，再用限制性内切酶切开已知序列，这样线性化后原位 于已知序列两侧的未知序列变为位于已知序列之间， 再经常规PCR操作就可大量 扩增未知序列。(4)

4、不对称PCR(Asymmetric PCR)不对称PCR又称单链扩增PCR 般PCR反应中两种引物的量是相等的，不对称PCR中，两种引物的量相差悬殊，一般为50:1-100:1，这样在生成一定数量的双链产物后， 较少的引物就会被用完，大量 生成一条单链的DNA分离单链即可直接进行序列分析等研究。(5) 多重PCR(MuItiplex PCR) 应用PCR技术可检测特定序列的存在或缺失。某些疾病的基因片段较长，且常有多处发生缺失或突变，用一对引物进行PCR检测时，扩增不到目的片段，此时就须使用多重PCR技术。在同一反应管中加入 多对引物，扩增同一模板的多个区域。如果某一片段缺失，或扩增该片段的引

5、物 与被检核酸同源性太低，则在相应的电泳图谱上就无相应的正常片段出现， 但可 保证其他特异片段出现。目前报道的多重PCF反应，最多可同时扩增12条区带。 当然，也可设计两对引物，分两次进行常规 PCR。(6) 着色互补 PCR(Colour complementation assay) 着色互补 PCR又称荧光PCR(Fluroscent PCR) 。其原理是用不同的荧光染料分别标记不同的寡核苷酸引 物,通过多重PCR同时扩增多个DNA片段。反应结束后除去多余引物，扩增产物 在紫外线照射下能显示某一种或几种荧光染料颜色的组合，如果某一 DNA区带缺 失，则会缺乏相应的颜色。通过颜色的有无及其组

6、合可很快诊断基因的缺失、 有 较大变异或发现某些感染的病毒基因等。 这一技术为PCR技术的临诊自动化诊断 打下了基础。 免疫PCR免疫PCR即免疫多聚酶链反应(Immuno- PCR)它是将高度灵敏 的PCF技术与特异的免疫学方法相结合的一种新型的诊断技术，是目前最有希望的诊断方法。它的原理是通过应用一个对DNA和抗体具有双重结合活性的联接分 子使二者联接起来，这样就可以使作为指示系统的DNA分子通过抗体而特异性地 结合到抗原上，从而形成一种特异性“抗原-抗体- DNA复合物”，再通过对其 中已知片段DNA的PCF扩增，即可证明抗原存在与否。这种方法的特点在于： 通过免疫捕获作用纯化检测对象；

7、 用于检测的微生物无需事先明确其核酸序 列；该方法也适用于微生物以外的抗原检测，其前提条件是被检测对象具有 良好的抗原性，并且备有其相对应的抗体；无需根据不同对象设计不同的引物。被联接的已知片段DNA®当于指示剂，无论检测对象是什么，只需合成针对 这段DNA的引物即可； 省去了普通PCR实验检测RNA病毒的反转录过程，即 增加了灵敏度又降低了实验成本。这项技术的发明者Sano，T.(1992) 等的试验表明，免疫PCR的灵敏度比ELISA方法高10万倍，足以检测出单个抗原分子。(8)套式PCR(Nested PCR)普通PCR的产物DNA®往需要再扩增，以便对之进 行进一步

8、鉴定、分子克隆或用作其他用途。此时，由于 DNA产物的末端效应，用 原来的那对引物难以实现再扩增的目的。如果在原来的引物内侧重新设计一对引 物，再进行新一轮PCR则很容易获得更大量的DNA产物。如果需要，还可再进 一步扩增，但每次需要在上一次产物的内侧重新设计引物。 这种采用多对成套引 物，逐步扩增DNA内侧片段的PCR就称为套式PCR目前很多分子生物学实验室 为了各自的研究需要都在应用这一技术。技术的用途(1) 传染病的早期诊断和不完整病原检疫 在早期诊断和不完整病原检疫方面，应用常规技术难于得到确切结果，甚至漏检，而用PCF技术可使未形成病毒颗粒 的DNA或 RNA或样品中病原体破坏后残留

9、核酸分子迅速扩增而测定，且只需提取微量DNA分子就可以得出结果。(2) 快速、准确、安全检测病原体 用PCF技术不需经过分离培养和富集病原体， 一个PCR反应一般只需几十分钟至2小时就可完成。从样品处理到产物检测， 一天之内可得出结果。由于PCF对检测的核酸有扩增作用，理论上既使仅有一个 分子的模板，也可进行特异性扩增，故特异性和灵敏度都很高，远远超过常规的 检测技术，包括核酸杂交技术。PCR可检出fg水平的DNA而杂交技术一般在 pg水平。PCF技术适用于检测慢性感染、隐性感染，对于难于培养的病毒的检测 尤其适用。由于PCF操作的每一步都不需活的病原体，不会造成病原体逃逸，在 传染病防疫意义

10、上是安全的。(3) 制备探针和标记探针 PCF可为核酸杂交提供探针和标记探针。方法是：经PCR各标记物掺入到新合成的DNA链PCR技术可准确鉴别某些比较近似的病 牛巴贝斯虫，二联巴贝斯虫等。 PCR用PCR直接扩增某特异的核酸片段，经分离提取后用同位素或非同位素标记制得 探针。 在反应液中加入标记的dNTP 中，从而制得放射性和非放射性标记探针。(4) 在病原体分类和鉴别中的应用 用 原体，如蓝舌病病毒与流行性出血热病毒， 结合其它核酸分析技术， 在精确区分病毒不同型、 不同株、不同分离物的相关性 方面具有独特的优势，可从分子水平上区分不同的毒株并解释它们之间的差异。 此外，PCRi术还广泛应

11、用于分子克隆、基因突变、核酸序列分析、癌基因和抗 癌基因以及抗病毒药物等研究中。技术应用概况 从诞生至今约十年的时间里，PCR技术已在生物学研究领域得到 广泛的应用。将PCR技术用于动物传染病的检疫研究也日趋广泛。例如，新西兰农渔部质量管理机构所属动物健康实验室 (AHLS )负责对各种外来病的疫情监测 诊断，该室在1992年建立了几项PCF检测技术，包括从结核病病灶中快速检测 牛分枝杆菌；快速检测患病牛羊中副结核分枝杆菌； 检测恶性卡它热和新城疫等。 自1990年始，将PCR应用于动物传染病的诊断等研究的报道，可归纳如下 ：(1) 快速诊断各类病毒病 用PCR成功进行检测的动物传染病病毒有：

12、蓝舌病病 毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛白血病病毒、马鼻肺炎病毒、恶性卡他 热病毒、伪狂犬病病毒、狂犬病病毒。非洲猪瘟病毒、禽传染性支气管炎病毒、 禽传染性喉气管炎病毒、马传染性肺炎病毒、马立克氏病毒、牛冠状病毒、鱼传 染性造血器官坏死病病毒、轮状病毒、水道猫鱼病病毒、水貂阿留申病病毒、山 羊关节脑炎病毒、梅迪维斯纳病毒、猪细小病毒等。PC般术的应用也日趋(2) 由其它病原体引起的传染性疾病的研究目前已报道的有致病性大肠杆菌毒 素基因、牛胎儿弯曲杆菌、牛分枝杆菌、炭疽杆菌芽孢、钩端螺旋体、牛巴贝斯 虫和弓形虫等的PCF检测研究。在食品微生物的检测中， 广泛。Hornes等(1991)采用

13、一种固相比色PCR技术成功检测了大肠杆菌热稳定肠毒素 (STs)Ia(STIa) 和 Ib(STIb) 基因。( 二) 连接酶链反应 在连接酶的作用下两段寡核苷酸能通过形成磷酸二酯键而 连接形成较长的核酸片段。连接酶链反应 (Ligase Chain Reaction，LCR)技术基 于如下原理：在65°C，由于热稳定连接酶的作用，两段与模板正确杂交的寡核 苷酸能连接形成新的较长的核酸片段。 通过高温变性、 适温退火和连接三步一循 环的反应， 新形成的靶核酸片段成为下一循环的模板而使反应延续， 这样，扩增 产物将象PCF一样呈指数递增。P CR要 低。LCR反应体系需采用4个寡聚核苷

14、酸引物，其中两个与模板正链结合，另两个与 负链相结合。引物长约15-20bP,故LCR扩增产物长约30-40bp。由于扩增产 物较短，循环反应中的变性温度一般应比常规热稳定连接酶分离自嗜热细菌，它能精确识别与模板正确杂交的寡核苷酸引物。 由于碱基误配而杂交上模板的非特异引物将不能起连接反应。与PCF相比较,LCR中非特异性扩增产物产生的几率很低，有资料表明，经过50- 70个LCR循环，非特异性扩增产物未有明显增长，这样，可保证反应的高度敏感性和特异性。LCR已应用于检测人乳头瘤病毒、结核分枝杆菌等病原体。目前，LCR的应用范围远不如PCR广泛，但LCR与PCR相结合，可有效解决分子生物学研究

15、领域的 一些问题，如启动子等小片段核酸的克隆等。(三)Q P复制酶技术 QP复制酶是QP噬菌体产生的一种依赖于 RNA的RNA 聚合酶。该酶于1963年由Haruna和Weissmann等人发现并命名。Qp复制酶能 以某些单链RNA为模板，在体外大量复制单链 RNA该酶有严格的模板特异性， 能在体外充当QP复制酶模板的所有RNA分子均含大量的二级结构，且模板和产 物RNA必须能在复制过程中形成稳定的分子内二级结构。Lizardi及其合作者（1988）发现，在Qp复制酶的天然模板MDV-1RNA中插入一 段疟原虫（Plasmodium falciparum） 的特异序列后，所形成的重组 RNA片

16、段仍可 做为模板被QP复制酶大量扩增。经37r反应半小时，可在模板含量最低的反 应体系（约含1 000个分子）检测到129ng的重组RNA分子，相当于1亿倍扩增。 QP复制酶能扩增经过修饰的RNA片段，因此可应用于诊断和检测单链RNA或 DNA 序列。据 1992年发表的有关资料介绍， Gene Trak Systems 的科研工作者已在用 Qp 复制酶开发传染病诊断的技术。 其技术要点如下：先用硫氰酸胍处理生物材料 （如 血、尿、脑脊髓液），使RNA释放出来。由于QP复制酶通常不复制欲扩增的特 异RNA序列，如HIV1 RNA因此，待检材料须再做如下处理，先用一捕获探 针（捕获探针与一种磁性小球偶联）通过杂交反应将HIV-1 RNA“钓”出来，随后 洗脱其它未结合的RNA分子；将捕获探针和 HIV-1 RNA的复合体与插入另一段 HIV-1 RNA序列的重组MDV-1 RNA4