油菜素甾醇类物质的生理作用及信号传导11

1、精品 油菜素甾醇类物质的生理作用及信号传导一：概述要了解一个物质的生理功能，首先我们应该了解这个物质是什么，如何生成等基本问题，所以在介绍其生理作用及信号传导前，首先介绍一下什么是油菜素甾醇类物质。油菜素甾醇（Brassinosteroids，BR）是一大类植物甾醇类激素，广泛分布于高等植物中。其具有促进植物细胞生长的作用，并在植物发育中处于着至关重要的地位。它是最近几十年来被新确认的植物激素，被称为继生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯之后的第六大激素，其他植物激素包括茉莉酸、水杨酸、独脚金内酯等。最近十几年的研究也揭示了油菜素甾醇信号传递的途径，为其在农业和其他领域的应用奠定了基础。（

2、 BL的结构式）甾体长期被当做是多细胞动 物的激素，直到1970年代Michelle从植物中把甾体分子的激素活性发现，把一种从油菜（Brassica napus）花粉中提取的促进生长的物质鉴定为甾体化合物，并命名为油菜素内酯（brassinolide，BL）。从此以后，具有与BL相似结构和活性的甾体分子不断被发现，统称为油菜素甾醇。油菜素甾醇为甾醇类激素，是一类环戊烷多氢菲，与动物甾体类激素相似但是作用机制不同，它不经过细胞核内受体发挥作用，而是通过细胞膜表面受体传递信号。由于很低浓度的油菜素甾醇就可以强烈诱导生长和分化，以及利用模式生物拟南芥（Arabidopsis th

3、aliana）中鉴定出BR缺失和BR不敏感突变体，发现了BR在发育中的功能。这些突变体表现出了许多生长缺陷，包括矮小、叶暗绿、开花延迟、雄性不育和全黑暗情况下的光形态建成，所以油菜甾醇已被公认为是一种能使细胞伸长、维管分化、根生长、对光的反应、抗逆、衰老等的基本植物激素之一。BR的合成有一系列酶的参与。与赤霉素和脱落酸的合成类似，油菜素甾醇的合成是萜类途径的一个分支。油菜素甾醇的合成开始于2个法尼醛二磷酸聚合形成C30的三萜三十碳六烯。三萜三十碳六烯经过一系列的闭环反应，形成五环的三萜前体环阿屯醇。后又合成前体菜油甾醇（Campesterol）、谷甾醇和胆固醇等。菜油甾醇首先生成菜油甾烷醇（c

4、ampestanol），然后经过早期C-6氧化和后期C-6氧化2条途径，转化为栗木甾酮，继而转化成油菜素内酯。现在油菜素甾醇已经在27个科的种子植物、1种羊齿类植物（问荆）、1种苔藓类植物（地钱）、1种绿藻（水网藻）等中得到了鉴定。因此，油菜素甾醇是一种在陆生植物进化之前就普遍存在于各种植物中的激素。在被子植物中，油菜素甾醇在花粉、花药、种子、叶片、茎、根、幼嫩的生长组织中均有较低浓度的广泛分布。现在多数实验表明，BRs缺乏长距离运输模式，可进行短距离运输。在施用BL处理后的种子，产量可提高45%。BR促进植物长大，因此生物量自然会增多，这在水果、蔬菜中有着重大的意义。BR参与调控植物株型的调

5、整，这在农业上也有着潜在的用途。比如控制株型大小、种植密度等。外源的表油菜素内酯处理后，作物对各种环境胁迫，如热胁迫、冷胁迫、干旱等的耐受性均会有较大幅度的提高。二、生理作用油菜素甾醇为甾醇类激素，也是一类环戊烷多氢菲，但其与动物甾体类激素的作用机制不同，不经过细胞核内受体发挥作用，而是通过细胞膜表面受体传递信号。油菜素甾醇最早由Michelle于1970年发现。他从油菜花粉中提取出了一种能促进植物茎杆伸长和细胞分裂的高活性物质，将其称为油菜素（Brassins）。由于很低浓度的油菜素甾醇就可以强烈诱导生长和分化，并且通过进一步的对拟南芥（Arabidopsis thaliana）的分子遗传学

6、研究，证明油菜素甾醇是一种植物激素。合成途径：BR的合成有一系列酶参与完成。与赤霉素和脱落酸的合成类似，油菜素甾醇的合成也是萜类途径的一个分支。油菜素甾醇的合成开始于2个法尼醛二磷酸聚合形成C30的三萜三十碳六烯。三萜三十碳六烯经过一系列的闭环反应，形成五环的三萜前体环阿屯醇。油菜素甾醇的合成前体为菜油甾醇（Campesterol）、谷甾醇及胆固醇等，其来源于环阿屯醇。菜油甾醇首先生成菜油甾烷醇（campestanol），然后经过早期C-6氧化和后期C-6氧化2条途径，转化为栗木甾酮。两条途径在栗木甾酮处合并，继而转化成油菜素内酯。油菜素唑Brz（Brassinazole）是一种BR合成的特异

7、性抑制剂，其抑制油菜素内酯合成途径中催化6-氧-菜油甾烷醇生成卡它甾酮的单氧酶CYP72B1 DWF4的活性。BR，是新型植物激素，在不同情况下对植物生长发育表现出特殊的调节作用，但因其性质不完全符合植物激素的严格定义，一般称之为植物激素类似物。合成机制如下图：生理作用：BR在植物的生长发育中有着重要的作用，与其他植物激素一起参与调控植物发育的很多方面，包括茎叶的生长、根的生长、维管组织的分化、育性、种子萌发、顶端优势的维持、植物光形态建成等。另外，对于植物的对环境胁迫的防御中也有重要作用。油菜素内酯（BS）与根系的生长发育有关系，它在很低浓度水平下能表现出强的生活性。有实验表明在黄化水稻幼苗

8、第二叶片弯曲实验中，油菜素内酯在0.005mg/L时即可产生明显的倾斜效应。而生长素、赤霉素虽也有此反应，但一般在较高浓度下，才表现出倾斜效应。与传统的五大类植物激素相比，其作用机理独特、生理效应广泛、生理活性极高，但用量仅是五大类激素的千分之一。BS和BR可以促进胚芽鞘的生长提取的BS与合成的BR均能促进植物胚芽鞘的伸长，且生理活性相似。以下是BS和BR对水稻胚芽鞘伸长的作用BR可提高幼苗光合速率以玉米幼苗为例，epihomoBR浸种后，玉米品种铁单10号幼苗根力活力、根干重、叶面积、地上部干重、充实度、叶绿素a含量、光合速率、玉米素含量均有提高；叶鞘主脉出维管束细胞径向增大，细胞壁增厚，同

9、时维管束变大。 实验表明，经BR浸种处理，除了能增加光合面积外，还能显著提高光合速率，这充分说明BR能有效提高苗期光合作用，为培育壮苗，增加秧苗干物质的积累创造有利条件。BR浸种后推断其提高光合速率的机制有两种可能：一是浸种处理提高了叶片的素质。二是BR浸种提高了幼苗叶片内ZR（玉米素）的含量，机制如下图所示：BS生物活性具有稳定性通过实验，提取的BS促进黄化水稻第二叶切段的效果随BS处理浓度的增大而增加，随BS处理时间的延长而增加，如下图，BS处理时间与黄化水稻叶片倾斜角度的关系，说明BS的生理活性很稳定。油菜素甾醇类与生长素能够相互作用。近年来研究表明，BR与生长素能协同调节基因的表达，二

10、者在代谢、运输和信息转导等不同层次上存在相互作用，并且这两种信号与其他信号转导途径，如激素信号转导途径和光信号转导途径之间也存在信号对话。1. 协同调节基因的表达近年来随着基因芯片技术的应用，推动了BR调节基因表达的研究。Mussig等利用基因芯片技术，比较BR处理和对照植株，以及BR缺失型突变体和野生型植株的基因表达，发现BR对一些生长素反应基因也有调节作用，BR能快速诱导生长素早期基因IAA3和IAA19的表达，并且这种诱导不仅依赖于生长素的水平。ARF1是与生长素反应元件结合的转录因子，ARF1结合蛋白（ARF1 PB）的功能很可能是调节ARF1的活性。在BR处理的拟南芥植株中ARF1

11、PB表达较少，这表明BR通过调控ARF1 PB基因与生长素协同调节生长素影响基因的表达。而生长素也能增强BR响应基因TCH4的表达。2. BR和生长素与其他植物激素的相互作用除了BR生长素之间存在相互作用外，它们还会共同语其他植物激素相互作用，以调节植物的生长发育。如在拟南芥中，BL能诱导GA20氧化酶基因（GA20ox）的表达，在豌豆中，生长素能抑制该基因（PsGA20oxl）的表达。3. BR和生长素与光的相互作用Reed研究发现BR和生长素共同调节AUX/IAA蛋白和GH3蛋白，同时还可能调节植物的光反应。在酵母双交中，光敏色素A（PHYA）能与AUX/IAA蛋白相互作用，如燕麦中的PH

12、YA在体外能磷酸化IAA1、SHY2/IAA3、IAA9、AXR3/IAA17和豌豆中的IAA4等AUX/IAA蛋白。这些实验证据从水分子水平揭示了BR和生长素与光信号之间的相互作用。 二、信号传导油菜素甾醇的细胞信号通路研究是最近植物学领域最前沿的领域之一。通过十多年的分子遗传学、生物化学、蛋白质组学和结构生物学研究，已经基本建立了完整的油菜素甾醇细胞信号转导途径。在油菜的近亲-模式生物拟南芥中发现了BR不敏感突变体，找到的这些拟南芥突变体不仅包括BR生物合成酶的突变，也有感知和传导BR信号的信号蛋白的突变。BR的信号转导级联反应途径：细胞表面受体激酶BRI1感知BR BRI1激酶通过与共受

13、体BAK1的配体诱导契合和相互磷酸化 BKI1的解离而被激活 BRI1继而磷酸化BSK1，接着激活BSU1 BIN2由于BSU1催化其Tyr的去磷酸化而被抑制 引起去磷酸化BZR的核内累积和BR应答基因的表达BRI1在细胞表面感知BRBR不敏感突变体bri1 (brassinosteroid insenstitive 1)是用外源BR处理后仍保持矮小的不敏感状态而鉴定出来的。bri1的其他等位突变体促使了BRI1基因（编码LRR-RTK蛋白）的克隆。BRI1的胞外域包含了24个富亮氨酸重复序列（LRR）和一个位于第20和21个LRR之间的“岛”区域（ID）；胞内结构域包括一个Ser/Thr激酶

14、结构域、一个近膜区（JM）和一个C末端序列。几组实验证明BRI1的功能是作为BR的受体。这些实验包括：嵌合受体BRI1-XA2能在BR诱导下引发防御反应、拟南芥内源的或者大肠杆菌表达纯化的BRI1能与氚标记BL（3H-BL）免疫共沉淀结合、BR能诱导BRI1的自磷酸化。更深入的研究显示，含94个氨基酸残基的ID-LRR21结构域（包括岛区域ID和紧挨着ID的LRR21）是BR结合的充分条件。这些研究就证明BRI1是BR受体，并给出了一种新的甾体结合基序。BR结合到BRI1的胞外域后，激活胞内激酶，进而将信号传递到胞内其它蛋白分子。28个bri1位点突变的大部分都位于ID-LRR21或胞内激酶结

15、构域，这与BRI1的BR结合和激酶活性的基本功能相吻合。结构域-结构分析也揭示了JM和CT结构域的重要作用。去掉JM结构域能消除BRI1的信号功能，这暗示JM在BRI1的功能发挥中起着正调控作用。相反，去掉BRI1碳末端49个氨基酸残基后，在体外实验中激酶活性更高，转基因到bri1突变体植物后挽救bri1表型更强，这暗示CT起着自抑制的作用。CT区包含很多磷酸化位点，将这些Ser/Thr位点突变为模拟磷酸化的酸性氨基酸后的效应与去掉这个区域的效应相似，暗示CT区域的磷酸化能帮助激活激酶。这可能是通过C末端尾巴通过构象改变而释放自抑制功能而发生的。BR增加BRI1与其共受体BAK1异源寡聚化，诱

16、导受体激酶二聚体化和寡聚体化动物中的许多研究显示，受体激酶的激活通常需要配体诱导的同源或异源二聚体化，或着异源寡聚体化。BRI1的同源二聚体化最早是通过对豌豆原生质体的质膜进行荧光能量转移共振实验（FRET） 而检测到的。在此之后，单分子检测技术证明质膜中大约20%的BRI1分子是以同源二聚体形式存在的，并没有更加高级的寡聚体化。 拟南芥转基因植株中BRI1-GFP和BRI1-FLAG融合蛋白的免疫共沉淀实验也检测到了BRI1的同源二聚体化。尽管在原生质体中，BR对BRI1的同源二聚体化几乎没有作用，但BR处理拟南芥植物后，BRI1-GFP和BRI1-FLAG的免疫共沉淀增加了，这就暗示BR能

17、促进或者是稳定BRI1的同源二聚体化。目前尚不清楚BR是像生长素诱导TIR1-IAA的二聚体化一样，作为分子胶水来帮助稳定BRI1同源二聚体；还是BR结合后引起构象变化成为更加偏爱同源二聚体的形式。据估算，每一分子BL能结合一个分子的BRI1-GFP，这就支持了第二种可能性。目前也不是很清楚BRI1激酶活性对BR诱导的BRI1同源二聚体化是否是必要的。不管怎样，BR诱导的BRI1同源二聚体化并不足以完全激活BRI1激酶，还需要共受体激酶BAK1的结合。BAK1是由两个独立的研究小组分别采用酵母双杂交的方法筛选BRI1互作蛋白和激活标签筛选bri1-5抑制蛋白的方法鉴定到的。BAK1也叫SERK

18、3，是SERK家族（SERK1-SERK5）五个成员中的一个。它也是LRR-RTKs，包含有一个具有5个富亮氨酸重复的小胞外域（图）。过表达BAK1能抑制bri1弱突变体的表型。bak1功能缺失突变体表型与bri1弱突变体类似，并且过表达激酶功能缺失的bak1突变体具有强烈的矮化表型，与bri1强突变体类似，推测这是由于显性抑制效应的结果。最近的BAK1/SERK3及其同源蛋白（SERK1和SERK4）的功能缺失遗传学研究阐明了他们在BR信号中的重要作用，与在其他通路中一样。在体外实验和酵母实验中，BRI1和BAK1的激酶结构域能相互作用并转磷酸化，并且他们的体内相互作用已经通过转基因拟南芥的

19、免疫共沉淀实验和原生质体的荧光能量转移共振实验证实。BRI1和BAK1在体外实验中，都有本底激酶活性，相互由对方作用后迅速增加。在酵母中，只有野生型BRI1和BAK1共表达的时候才能检测到激酶活性，突变或者缺失BRI1或BAK1都不能检测到。这些结果暗示，BRI1和BAK1受体激酶活性的完全激活需要相互之间的转磷酸化。图1：BRI1和BAK1的结构。BRI1由24个富亮氨酸重复LRR、1个含70个氨基酸的岛区域ID、单跨膜区TM、近膜区JM、激酶结构域KD和C末端尾巴CT组成。BAK1由4个亮氨酸拉链LZ、5个LRR、1个富脯氨酸区、单跨膜区TM、激酶结构域KD和一个CT组成。黑色方框表示推测

20、的信号肽序列，灰色方框表示未知的区域。AL表示激酶结构域的激发环。圆圈表示得到证实的磷酸化位点，带方框的P表示推测的磷酸化位点。激活型磷酸化位点用红色表示，抑制性磷酸化位点用蓝色表示，对激酶活性没有明显效应或者没有得到实验验证的用黄色表示。在拟南芥中，BR处理能促进BRI1和BAK1的相互作用并增加它们的磷酸化水平。BR诱导的BRI1-BAK1结合似乎是由它们的激酶结构域介导，而不是胞外域的共同结合。首先，BR结合BRI1并不依赖于BAK1，BAK1也不参与BR与BRI1的结合，在bak1无义突变体和BAK1过表达的植株中，BL结合BRI1的活性都没有发生变化。其次，BRI1与BAK1的相互作

21、用依赖于它们的激酶活性。将BAK1的激酶结构域突变后，体外相互作用减弱；BRI1的激酶结构域突变为没有激酶活性形式后，它们的相互作用几乎完全消失。一个BRI1激酶活性丧失的突变体不能表现出BR诱导的与BAK1的结合，这暗示对于BR诱导的BRI1与BAK1的结合，完整的胞外域并不是充分条件，而BRI1激酶活性却是必要条件。然而，酵母中BAK1胞外域亮氨酸拉链中的L46E突变似乎丢失了BAK1与BRI1的结合。虽然这个结果可能支持了胞外域在BRI1-BAK1结合中的作用，但缺乏与BRI1的相互作用也可能是由于突变BAK1蛋白的定位错误（如滞留在内质网中）或在细胞中的不稳定性。另一方面，一个BAK1

22、激酶活性丧失的突变体在BR处理后仍能与野生型BRI1结合，这暗示BR首先激活BRI1激酶，BAK1与BRI1的结合是第一步BRI1激酶激活的结果。BRI1激酶活性的对于与BAK1相互作用和BAK1的激活的必要性也与一个观察到的现象一致，即BAK1过表达只能抑制bri1弱突变的表型，而不能抑制bri1-5 det2双突变和bri1无义突变的表型。以上这些结果显示，BAK1参与BRI1的激活，不参与将BR信号传递到下游物质。受体激酶的团体行动和多重任务处理BRI1是高等植物中主要的BR受体。番茄、水稻和豌豆中BRI1的直向同源物突变能引起BR不敏感的表型。然而，BRI1并不是唯一的BR受体。拟南芥

23、中有3个很接近于BRI1的同源蛋白，其中至少2个BRL1和BRL3能高亲和地结合BR。并且，以BRI1启动子表达这两个蛋白后，能挽救bri1突变体的表型。这些BRI1同源蛋白似乎能介导维管组织中细胞类型特异的BR反应。这种BRI1同源蛋白的功能特化在进化中显然是在单子叶植物和双子叶植物分化之前形成的，因为水稻的OsBRL1和OsBRL3也能介导组织特异的和细胞类型特异的BR反应。BAK1也属于RLKs家族中的SERK亚家族（SERK1-SERK5）。除了BAK1（SERK3），2个SERK家族的其他成员SERK1和BKK1（BAK1-like 1，SERK4）似乎在BR信号中起着和BAK1冗余

24、的作用。和BAK1一样，过表达SERK1或BKK1都能部分抑制bri1-5的表型；体内实验中，它们也能与BRI1相互作用。虽然bak1功能确实单突变只有比较弱的矮化表型，但bak1 serk1-1双突变的BR不敏感的矮化表型显著增强，bak1-4 bkk1-1双突变和bak1单突变相比，只有去黄化轻微增强的表型。遗传学研究也发现了BAK1和SERK家族其他成员在多个信号通路中的作用。BAK1和BKK1/SERK4参与控制光依赖性细胞死亡过程。bak1 bkk1双突变体表现出光下的幼苗致死表型，但在暗处却没有。在bak1 bkk1双突变中能观察到细胞死亡表型的多个方面，包括防御相关基因的上调和胼

25、胝质、H2O2的积累，但在每个基因的单突变和bri1无义突变体重却没有这种现象。这就暗示BAK1和BKK1在抑制不依赖于BR信号的细胞死亡通路中起着冗余的作用。BAK1在病原菌感染后的植物发病过程中起着非常重要的作用。bak1突变体对腐殖营养病原菌感染表现出更强的易感性。用BR处理后，只能抑制bak1的生长缺陷表现，而不能抑制他的疾病易感表型，这就支持了BAK1在防御中不依赖于BR的假设。另外，bak1突变体对病原菌相关分子模式（PAMPs）如鞭毛蛋白、EF-Tu、INF1和CSP22表现出敏感性降低。更加深入的研究显示，用鞭毛蛋白处理后，BAK1能与鞭毛蛋白受体FLS2（也是一种LRR-RT

26、K）相互作用。这些结果显示BAK1在鞭毛蛋白信号途径中能作为FLS2的共受体。Shan及其同事报道了细菌性病原菌的毒性因子能与targetBAK1以战胜寄主防御系统，同时抑制BR信号通路。过表达细菌效应蛋白AvrPto的转基因植物具有与bri1弱突变体相似的矮小表型，AvrPto和AvrPtoB也能与BAK1相互作用，导致FLS2-BAK1结合的瓦解。SERK1和SERK2在雄性孢子发生中起着冗余作用。serk1 serk2双突变因为花粉绒毡层发育缺陷而雄性不育。综合起来，SERK家族的四个成员似乎在4个不同的途径中起着相互重叠的作用：BAK1、SERK1和BKK1/SERK4在BR信号通路中

27、起作用；BAK1和BKK1/SERK4在细胞死亡控制中起作用；BAK1在鞭毛蛋白信号途径和自然免疫中起作用；SERK1和SERK2在雄性孢子发生中起作用。一个基因家族的成员可能是通过基因duplication产生的，这样最早得到的基因拷贝功能上就是完全冗余的。SERK家族不同成员是如何获得并保持自身特定的功能的在进化上是一个有趣的问题。功能上的特异性或许是由启动子和编码序列的改变而产生的，结果就导致了多种多样的组织特异性基因表达和蛋白活性。用SERK1或SERK2的启动子驱动SERK3的表达并不能拯救serk1 serk2双突变体的雄性不育表型，这说明SERK蛋白功能是特异的。相反，BRI1同

28、源蛋白的功能特异性是通过启动子改变和基因表达模式改变而获得的，因为用BRI1启动子驱动表达BRL1也能拯救bri1的表型。番茄BRI1的双重功能是值得注意的，即还能与系统素结合，然而，这项发现之后受到争议。近期的研究发现得出结论：番茄BRI1对于BR信号是必需的，但对于系统素的信号不是必需的。与此类似，孕酮被发现能与一些动物细胞中的催产素的G蛋白偶联受体结合，但这些结果也是随后颇受争议。通过自磷酸化和转磷酸化调控 为了了解BRI1和BAK1的信号机制，最新的几项的研究主要通过质谱（MS）鉴定出了它们激酶结构域的磷酸化位点（图1）。体外的磷酸化位点鉴定是通过分析大肠杆菌表达并纯化的重组胞内结构域

29、实现的，而体内磷酸化位点鉴定是通过分析免疫共沉淀的转基因拟南芥的表位标记BRI1或BAK1而实现的。这些研究明确鉴定出了11个BRI1中的磷酸化位点（6个是体内磷酸化位点，5个只在体外磷酸化）。质谱数据也说明存在不属于特定氨基酸残基的其他磷酸化位点，包括存在于第VII和第VIII结构域之间激发环上的至少3个位点。此外，磷酸肽作图（phosphopeptide mapping）之后进行的定点突变证明其他位点存在磷酸化（S1162）。尽管最初的质谱数据只鉴定出了Ser/Thr残基的磷酸化，最近的一项采用磷酸肽特异性抗体和质谱分析的研究为BRI1的Tyr残基在体内和体外都能磷酸化给出了令人信服的证据

30、，这暗示BRI1是一个双重特异性激酶。许多鉴定出的或推测出的BRI1磷酸化位点的功能已经通过定点突变后的体外激酶实验和bri1表型挽救实验得到了研究。这些研究证明BRI1激发环的磷酸化对于激酶活性具有及其重要的作用。体外实验中，S1044/T1045、T1049、Y1052、Y1057突变的BRI1几乎完全丧失激酶活性，并且不能挽救bri1-5的表型。两个激发环外的Tyr位点突变（Y956和Y1072）也失去了激酶活性，尽管在体内还没有检测到Y1072的磷酸化。BRI1的JM区和C末端结构域磷酸化的重要作用也被证明了。去除JM区后，BRI1不能发挥信号作用和拯救bri1-5突变体表型，并且没有

31、影响BRI1在质膜上的定位。通过质谱分析，鉴定出了JM区的7个磷酸化位点，它们在体内和体外实验中能自我磷酸化。其中，四个磷酸化位点的模拟磷酸化替代（S838D、T842D、T846D和S858D）在没有BAK1的情况下增强了BRI1自身的磷酸化，说明JM区的磷酸化激活了BRI1。然而，JM区调制BRI1活性的激活机制目前仍不清楚。与JM相反，在体外实验和体内实验中，去除CT区域的BRI1能增加BRI1的激酶活性，且比野生型BRI1更加有效促进地bri1-5和det2突变体的下胚轴生长。CT尾巴的多个Ser/Thr位点都是磷酸化的，其中8个可能的位点中的4个（S-1162、S-1166、S-11

32、68和T-1180）已经被实验证实。将CT的多个Ser/Thr残基替换成Asp后能显著增加BRI1不依赖于BAK1的激酶活性。此外，将CT尾巴包含模拟磷酸化突变位点的BRI1突变体能更加有效抑制det2的矮化表型缺陷。这些研究结果说明，BRI1的CT尾巴是其激酶结构域的自抑制区，磷酸化可以减轻抑制效应。BRI1的JM区和CT尾巴的功能说明，胞内域的非催化部分在特异性调节激酶的活性中起着重要作用。哺乳动物受体激酶胞内非激酶结构域不仅在自调节中起重要作用，也为底物创造结合位点，而这些作用是依赖于磷酸化状况的。同样，BRI1的JM区和CT尾巴也可能参与调节激酶活性，并能为BRI1下游底物创造结合位点

33、。目前已经鉴定出了BAK1胞内域的9个磷酸化位点，其中5个（S290,T312,T446,T449, T455）在体内磷酸化，4个在体外（S286,T450,S604,S612）。和BRI1不同的是，BAK1的磷酸化主要发生在激发环（T446,T449,T450,T455）上，不过最近在体外也鉴定到了CT尾巴上的2个磷酸化位点（S604，S612）。BAK1激发环上对应于BRI1 T1049的T455残基的磷酸化在其功能发挥中是必需的，因为将T455突变为A以后，激酶活性丧失。尽管激发环上其他磷酸化位点的单突变对BAK1的活性没什么影响，但将所有3个Thr突变为Ala（T446A/T449A/

34、T450A）后激酶活性也会丧失，预示激发环的磷酸化对BAK1的激酶活性至关重要。虽然分析体外自磷酸化位点和体内磷酸化位点已经阐明了其磷酸化状态能影响激酶活性和信号功能的重要氨基酸残基，但BR调控这些位点磷酸化过程的机制仍然不清楚。最近，有人提出BR诱导的BRI1和BAK1的结合是BRI1激酶第一步激活的结果，接下来BRI1和BAK1相互转磷酸化，进而激活这两个受体激酶。BR诱导的BRI1和BAK1的结合依赖于BRI1的激酶活性而非BAK1，因为BR能增加野生型BRI1和激酶活性丧失BAK1的互作，但不能增加突变体BRI1和野生型BAK1的互作。尽管突变体BRI1仍然能与BAK1有基底水平的互作

35、，但其不能由BR处理而增加。此外，BRI1过表达能增强BR诱导的BAK1磷酸化，但在bri1无义突变体中没有此效应。相反，在bak1 bkk1（serk3 serk4）双突变背景下，BR处理仍能诱导BRI1磷酸化，虽然和在野生型背景和BAK1过表达背景下的相比，其磷酸化水平要低一些。体外实验中，BAK1对BRI1的预磷酸化增加了BRI1对底物特异的磷酸化水平，暗示BRI1具有能被BAK1转磷酸化显著增强的基底水平磷酸化。此外，过表达BRI1能拯救bak1 bkk1双突变体的下胚轴伸长表型，而过表达BAK1却不能抑制bri1无义突变体的表型缺陷。然而，在bak1 bkk1双突变体内SERK1可能

36、仍有功能，因为它也能与BRI1结合并对BR信号起作用。这样，为了了解BAK1及相关蛋白是否在BR诱导的BRI1激活中起着必要性的作用还是支持性作用，还需要研究bak1 bkk1 serk1无义三突变体。BRI1和BAK1的相互激活由转磷酸化介导。通过以一个激酶失活蛋白作为另一个野生型蛋白的底物的体外激酶实验，已经鉴定出了转磷酸化的位点。质谱（MS）数据显示BRI1主要磷酸化BAK1的激酶结构域。有6个BAK1残基能被BRI1磷酸化（S290，T312，T446，T449，T450，T455），其中的4个Thr残基（T446，T449，T450，T455）位于激发环，对于BAK1的激酶活性和信号

37、功能是必需的。将T455突变为Ala，或者将T446、T449、T450全部突变为Ala后，BAK1的活性均会丧失。所以，BAK1磷酸化这些残基后，可能就激活了BAK1。与BRI1磷酸化BAK1的激发环不同，BAK1主要磷酸化BRI1的JM区和CT尾巴。已经鉴定出BAK1转磷酸化BRI1的位点是JM区的3个残基（S838,T846,S858）和CT尾巴的2个残基（S1166,T1180）。此外，JM和CT的模拟磷酸化突变体的BRI1激酶活性增强；且JM区Ser/Thr替换为Ala后的bri1突变体在抑制bri1-5的短下胚轴表型缺陷上，比野生型BRI1更弱。这些结果就支持BAK1通过磷酸化JM

38、和CT结构域来激活BRI1的假说综合起来，这些结果也就支持了一个BR激活BRI1-BAK1受体激酶的顺序磷酸化模型：BR结合诱导BRI1激酶的基底水平激活，然后BRI1与BAK1结合并磷酸化BAK1的激发环从而激活BAK1；激活的BAK1磷酸化BRI1的JM和CT而完全激活BRI1的激酶活性，通过增强BRI1磷酸化下游底物的能力实现其信号功能。虽然磷酸化大多数位点都能激活激酶活性，但突变研究也找到了一些磷酸化能抑制激酶活性的位点。BRI1的T872A突变能增强激酶活性十几倍：其Vmax增加且Km减小。这说明T872的磷酸化具有负调控激酶活性的作用，不过也有可能是因为将这个Thr替换为Ala后，

39、蛋白构象改变成了更有活性的状态。另外，BAK1的S286D突变在体外和体内实验中能使BAK1失活，但S286A却没有什么作用。在体外检测到S286是作为BAK1的自磷酸化位点。目前仍不清楚的是，BAK1的S286在体内的自磷酸化是一种脱敏机制，还是一种其他激酶调控BAK1活性的机制。一些磷酸化位点除了影响激酶活性，似乎也能介导特异性的信号输出。BRI1中JM区的Y831F突变对激酶活性没有明显影响，但表达Y831F突变的BRI1却能拯救bri1-5的生长表型缺陷，导致叶片更大、开花提前。这就意味着Y831的磷酸化可能对叶片发育和调控开花具有信号输出功能。此外，包含激发环上T450A突变的BAK

40、1表达也能拯救bak1 bkk1双突变的细胞死亡和矮化表型缺陷，但不能拯救其鞭毛蛋白不敏感表型（91）。以上结果说明，个别磷酸化位点可能影响特异性的信号输出。BRI1和BKI1的内吞在哺乳动物和酵母中，内吞是将激活的受体从质膜传递到下游靶标、将受体从细胞表面清除以终止信号和使系统脱敏的普遍机制。最早研究人员在豌豆原生质体中观察到了BRI1和BAK1的内吞，且在原生质体中共表达BRI1和BAK1能加速内吞。最近，在拟南芥根细胞核内体中观察到了不依赖于BR处理的BRI1-GFP。一种阻止从初级核内体向次级成熟核内体的抑制剂Brefeldin A（BFA）能诱导BRI1-GFP在核内体小泡中的积累。

41、有趣的是，BFA处理能激活BR信号，引起BZR2/BES1的去磷酸化和抑制DWF4的表达。相反，一种影响PM/核内体间运输的化学物质Endosidin 1能使BRI1-GFP在大的胞内体（large intracellular bodies）中积累，并有与bri1相似的矮化表型。BRI1的内吞似乎不受BR调控，但在原生质体中过表达BAK1能使其增强。SERK1也是向胞内运输的，其内运与激酶相关的蛋白磷酸酶相关（KAPP）。KAPP具有一个磷酸化肽结合结构域（FHA），并依赖于激酶活性而于SERK1互作。共表达KAPP能增强SERK1的内运。尽管KAPP和SERK1都定位于细胞膜，但FRET检测

42、发现，其生理互作只发生于胞内小泡（vesicles）中。这样，就有KAPP控制SERK1 内运的假说。KAPP也能依赖于磷酸化状态而与BRI1和BAK1互作，其不能与激酶活性丧失的mBRI1（K911E）和mBAK1（T546A）互作。kapp bri1-5双突变对BL的敏感性比bri1-5单突变更强，这预示KAPP可能是一个BR信号途径的负调控原件。KAPP究竟是通过去磷酸化受体激酶抑制BR信号，还是通过促进内吞而抑制BR信号的尚需进一步研究。虽然这些研究说明了BRI1的正确定位对于其信号功能的重要性，但BRI1内吞的功能尚未知晓。基于BFA敏感的核内体BRI1对信号的正作用，有人提出内吞对

43、与胞内蛋白互作提供了额外的表面空间和可接近性，或者是小泡包围并捕获受体-配体复合物以维持BR的信号。在根中，后一种假说或许更加重要，因为水能洗脱掉胞外的信号分子。在拟南芥中，BRI1定位于大多数细胞的质膜上，而核内体 BRI1只是在根细胞中观测到。另一方面，我们仍不知道BRI1如何从细胞表面去除，比如说在停止生长的成熟组织中。我们也不知道BRI1的内运是否像动物系统的一些受体一样，是参与受体降解的一种方式。通过BKI1调控BRI1/BAK1受体的活性也受其他互作蛋白的调控。除了BAK1，几个其他的新BRI1互作蛋白也通过酵母双杂交的方法鉴定出来了。其中一个即是BKI1，它能够负调控BRI1的活

44、性。RNAi减少BKI1量能增强下胚轴的伸长，而过表达BKI1导致弱的矮化表型。此外，BKI1过表达能减少BR处理诱导的BZR2/BES1去磷酸化，也能改变BR调控的基因表达水平，这说明BKI1是BR信号的负调控原件。没有BR的时候，BKI1定位于细胞膜，但经BR处理后，BKI1迅速从膜上解离而到细胞质中。这些现象说明BKI1在细胞膜上与BRI1相互作用，使BRI1处于失活状态。BKI1抑制BRI1的部分原因也是阻止BRI1与BAK1的互作，因为在体外实验中，当与BKI1共培养后，BRI1与BAK1的互作减弱。一旦BR激活BRI1的激酶活性，BKI1即被BRI1磷酸化，并迅速与BRI1解离，使

45、BAK1能与BRI1结合并完全激活BRI1。为了支持这个假说，人工在BKI1的N末端加上豆蔻酰化位点而强制使BKI1定位于质膜上，能增强BKI1过表达植物的矮化表型。这些结果说明，BKI1是当BR浓度低的时候使BRI1处于基底水平的另一种控制方式。受体激酶的信号输出BRI1-BAK1受体复合物的信号输出应该由这些激酶的胞内底物介导。出了BAK1和BKI1，还有一些其他的BRI1互作蛋白被鉴定出来，并且，至少咋体外实验中能被BRI1磷酸化。这些蛋白包括位于细胞膜上的TTL蛋白（TRANSTHYRETIN LIKE）、TGF受体互作蛋白TRIP-1的同源蛋白、BSKs（BRI1 Signaling

46、 Kinases）。TTL在酵母中能与BRI1互作，在体外实验中能被BRI1磷酸化。过表达TTL能引起与bri1弱突变体相似的矮化表型，ttl敲出突变体显示出更强的BR敏感性和生长表型，这说明TTL通过与BRI1激酶互作而负调控BR信号。TTL与激活的BRI1的结合比与激酶失活的BRI1更强。这与BKI1恰好相反，因为BKI1与失活状态BRI1的结合更强。基于TTL定位于质膜上，有人提出TTL可能直接介导BR调控的控制细胞伸长的细胞膜的活性。目前还不知道TTL与BRI1的互作是否影响对BR相应的下游基因的表达。TRIP-1与哺乳动物TGF受体互作蛋白序列相似。TGF受体互作蛋白在TGF信号途径

47、中起重要作用，并且也是真核生物翻译起始因子eIF3的一个必需亚基。TRIP-1在体内实验和体外实验中，均能与BRI1互作；体内实验中，其至少有3个残基（T14，T89，T197或S198）能被BRI1磷酸化，暗示其为胞质内的BRI1激酶底物。有人提出TRIP-1可能在BR介导的翻译调控中起作用，然而还缺乏BR直接调控蛋白翻译的证据。最近，定量蛋白组学研究鉴定出了大量受BR调控的蛋白，但除了在翻译后磷酸化调控的BR信号原件以外，还没发现其他蛋白的蛋白水平和编码RNA水平的变化。通过二维差异凝胶电泳，对总蛋白的蛋白组学研究鉴定出了BR信号途径后期的响应原件蛋白，但进行磷酸化蛋白分析或质膜部分分析，

48、鉴定出了介导早期BR信号转导的响应蛋白。这包括BAK1和定位于质膜且只在BR处理后磷酸化的BR信号激酶BSK（BSK1、BSK2）（84）。BSKs属于含12个成员的RLCK XII亚家族，它们都包含有一个N末端激酶结构域和一个C末端tetratricopeptide基序。在拟南芥中，RLKs是一个拥有超过610个成员的大家族，其中25%是没有胞外域或跨膜区的RLCK（80）。在体外实验中，BSK1能被BRI1磷酸化，而不被BAK1磷酸化，且BRI1磷酸化BSK1的特定Ser残基（S230）。荧光免疫共沉淀检测到了BSKs与BRI1的体内相互作用，BR处理后，荧光免疫共沉淀的量减少，说明一旦磷

49、酸化，BSKs与BRI1解离。尽管大部分BSKs敲除突变体都没有明显表型，但bsk3敲除植物对BR的敏感性和对BR合成抑制剂BRZ的超敏感性减弱。在bri1-5中过表达BSKs能强烈抑制其矮化表型缺陷，使BR调控的基因表达恢复。此外，在bri1无义突变体中过表达BSKs能部分拯救表型，但不能拯救纯合bin2-1的表型，说明BSKs是位于BRI1下游、BIN2上游的正调控原件。BZR1和BZR2/BES1: BR调控基因表达的关键转录因子遗传学研究鉴定出了2个同源的转录因子，它们是BR信号途径的关键组分。遗传学研究还证明BR调控植物发育是通过调制核基因的表达来实现的。抗油菜素唑突变体bzr1-1

50、D突变体在没有BRZ和有BRZ的条件下像野生型，相反，野生型幼苗在BRZ条件下有去黄化表型。bzr1-1D突变体能完全抑制bri1的去黄化表型，且能部分抑制其矮化表型。BZR1是拟南芥中一个植物特有基因家族5个成员中的一个（图2）。bzr1-1D中的P234L突变能稳定BZR1蛋白，引起黑暗条件下组成性BR相应生长。在bes1-D（bri1-EMS-suppressor 1）突变体中也发现了BZR1最近的同源蛋白BZR2同一个位点的Pro到Leu的突变（BZR2氨基酸序列的88%与BZR1相同），因此，BZR1也叫BES1。过表达BZR1能增加下胚轴长度，T-DNA插入敲除突变体bzr2-1下

51、胚轴长度稍微减短。此外，RNAi干扰抑制BZR2/BES1及其同源蛋白能引起矮化表型，暗示BZR1和BZR2/BES1是BR信号途径中具有冗余作用的正调控因子。最近证明BZR1和BZR2/BES1是直接调控BR响应基因表达的转录因子。在一组实验中，BZR1与GAL4 DNA结合结构域的融合蛋白能抑制含GAL4结合位点的启动子-报告基因的转录，说明BZR1具有抑制转录的活性。染色质免疫共沉淀实验（ChIP）证明BZR1与BR合成相关基因CPD和DWF4的启动子区域结合，BR处理后能以负反馈机制迅速抑制这种结合。一系列体外DNA结合实验说明BZR1通过其N末端直接与CPD启动子对BR相应必需的CG

52、TGT/CG序列结合，这个序列也被称为BR相应原件（BRRE）。与BZR1通过BRRE抑制基因表达的结果一致，人们发现BRRE在大量的受BR抑制基因中含量丰富，包括一些BR生物合成基因。有趣的是，BRRE在BR诱导的基因中含量也稍显丰富。鉴于BZR1在BR合成反馈抑制和BR促进植物生长的过程中有着双重作用，推测BZR1可能通过与不同的元件互作来激活特定的启动子。与BZR1的转录抑制活性相比，BZR2/BES1能激活BR诱导的基因SAUR-AC1。BZR2/BES1与bHLH转录因子BIM1结合后，一起与SAUR-AC1启动子的E盒（CANNTG）结合。Transient过表达BZR2/BES1

53、和BIM1能激活SAUR-AC1启动子:GUS报告基因，说明BZR2/BES1和BIM1正调控SAUR-AC1的表达。虽然BIM1过表达和抑制表达实验都说明其在植物生长中起作用，但这些表型却很不明显。可能原因是其他的bHLH蛋白具有冗余作用，或者是BIMs只控制一些特定的受BR调控的基因和发育过程。事实上，一项最新研究鉴定出了2个含Jumonji结构域的蛋白ELF6和REF6，他们也是BZR2/BES1互作蛋白。之前的研究发现这两个蛋白能调控开花。此外，也有实验证明BIMs能与2个参与胚胎发育的AP2/ERF转录因子DORNROSCHEN和DORNROSCHEN-LIKE互作，且bim1突变体

54、具有低外显率的胚胎发育缺陷。这些结果说明BZR2/BES1通过募集其他转录调节因子来调制某部分靶基因的表达和特定的发育过程。图2：BZR1转录因子的结构。BZR1由一个富丙氨酸结构域AR、核定位序列NLS、DNA结合结构域DB、BIN2磷酸化结构域、14-3-3结合基序和一个富PEST结构域组成。星号表示推测的BIN2磷酸化位点，黄圈表示被BIN2体外磷酸化的位点，红圈表示被BIN2体内磷酸化的位点。（修改自Ref.16,21;T-W. Kim和Z.Wang未发表数据）BZR1和BZR2/BES1相反的转录活性也为bzr1-1D和bes1-D突变体在光下表型的不同提供了可能的解释。这两种突变体

55、都对BRZ不敏感、在暗光照条件下能抑制bri1的表型，但在光生长条件下表型相反，bzr1-1D是半矮化的，而bes1-D却有与BR处理植物相似的长叶柄和白化叶表型。通过BR处理或者过表达BR合成基因能拯救bzr1-1D的表型，这至少部分是由过度反馈抑制BR的合成引起的。相反的转录活性能够解释光生长突变体在细胞伸长上相反的效应。然而，这却与黑暗条件下和无BR条件下这些突变体具有相似的总体组成型BR相应的表型不一致。事实上，有研究显示BZR2/BES1也能介导CPD和DWF4的反馈抑制表达，BZR1也能介导BR诱导基因的激活。考虑到BZR1和BZR2/BES1具有几乎一样的氨基酸序列，尤其是DNA

56、结合结构域，有可能BZR1和BZR2/BES1具有相似的DNA结合和起始转录活性，只是它们在不同的组织表达，这样，对BR来源组织的BR合成和BR靶组织的细胞伸长就具有不同的效应。对BZR家族成员组织特异性表达的详细研究将揭开它们功能特化的谜团。此外，鉴定出BZR1和BZR2/BES1的所有靶基因对于理解BR信号途径的功能也是相当重要的。BIN2介导的磷酸化调控BZR1和BES1/BZR2作为BR信号途径的关键转录因子，BZR1和BES1/BZR2受上游元件严密控制。BR处理可诱导BZR1和BZR2的快速磷酸化，这个过程可以用免疫印迹方法检测到。结果显示，BZR1和BZR2应该是被一个负调控BR

57、信号反应的激酶磷酸化，这个激酶即是BIN2。bin2（又名dwf12或ucu1）是除bri1以外的另一个引起BR不敏感、矮小的植株表型的位点。跟bri1不同，bin2突变体是一个半显性功能获得性突变体。BIN2蛋白与GSK3有70%的相似性。GSK3s在真核生物中，从酵母到人类，是保守的，并且在众多的信号通路中发挥重要的作用。与一般的负调节因子相同，BIN2的过表达能引起与bin2-1相似的矮小表型，而BIN2或其同源蛋白的功能缺失型突变体促进细胞的伸长，并且部分挽救bri1-5表型，都印证了BIN2在BR信号通路中的抑制功能。若干证据都证明，BIN2通过磷酸化BZR1和BZR2来负调控BR信

58、号途径。首先，bzr1-1D和bes1-D突变体都充分抑制bin2-1突变体表型，这就支持了在BR通路中BZR1和BZR2是BIN2的下游因子的说法。其次，在酵母和在体外，BIN2都与BZR1,BZR2直接互作。第三，在体外BIN2能对BZR1和BZR2进行高效的磷酸化，BZR1和BZR2的这个转变这与BR处理后的转变相反。第四，在bin2-1突变体中，BZR1和BZR2的磷酸化以及累积水平受到抑制。另外，用化学抑制剂，如LiCl和bikinin对BIN2进行抑制，会引起BZR1和BZR2的积累。BZR1、BZR2和水稻的同源蛋白OsBZR1中有25个公认保守位点能被GSK3磷酸化，并且这些磷酸化位点似乎对转录因子有着不同的调控机制。BIN2磷酸化对于BZR1和BZR2的功能有多重抑制作用。首先，被磷酸化的BZR1进入26S蛋白酶体介导的降解过程，因为用蛋白酶体抑制剂MG132处理后，磷酸化的BZR1水平升高，而未磷酸化水平不变。但是现有数据对于BR处理能否引起BZR2水平的升高存在自我矛盾，在bri1和bin2-1突变体中BZR2水平均显著收抑制。其次，BZR1和BZR2的磷酸化抑制他们与DNA的结合活性。在体外BIN2-磷酸化BZR1复合体和BIN2-磷酸化