不同中药对豚鼠胆色素结石模型的生化学影响

1、不同中药对豚鼠胆色素结石模型的生化学影响    【摘要】 目的：观察中药清胆胶囊和养肝利胆颗粒对豚鼠胆囊胆色素结石模型的生化学影响。方法：雄性豚鼠皮下注射林可霉素建立胆色素结石模型，并设立空白组、模型组、清胆胶囊干预组和养肝利胆颗粒干预组，观察各组动物的成石率、胆汁中总胆红素（total bilirubin, TBIL）、游离胆红素（unconjugated bilirubin, UCB）和钙离子浓度等指标的变化。结果：与模型组比较，清胆胶囊组和养肝利胆颗粒组成石率均显著降低（P0.01），胆汁中总胆红素、游离胆红素和钙离子浓度也明显降低（P0.05，P

2、0.01）。结论：清胆胶囊和养肝利胆颗粒可通过降低胆汁中总胆红素、游离胆红素和钙离子含量而逆转成石胆汁，起到预防胆色素结石形成的作用。 【关键词】 利胆剂 胆色素类 胆结石 豚鼠Methods: An animal model of pigment gallstones was established in male guineapigs by hypodermic injection of lincomycin. The guineapigs were randomly divided into blank control group, untreated group, QDC group

3、and YGLDG group. There were 8 guineapigs in each group. After tenday treatment, animals were sacrificed and sampled to calculate the rate of stone formation, total bilirubin (TB), unconjugated bilirubin (UCB) and Ca2 density in bile of the four groups.Results: In comparison with the untreated group,

4、 the rates of stone formation in the QDC and YGLDG groups were significantly decreased (P<0.01). TBIL, UCB and Ca2 content of bile in both QDC and YGLD groups was also significantly decreased (P<0.05, P<0.01).Conclusion: QDC and YGLD have good effects on biochemical changes of animal model

5、of pigment gallstone in reversing the lithogenesity of bile by reducing the content of TB, UCB and Ca2 , hence resulting in clinical treatment and prevention of pigment gallstone disease.Keywords: choleretics; bile pigments; cholelithiasis; guineapigs肝胆管结石的主要类型为胆色素结石，这类胆石病在我国的发病率很高1。胆色素结石主要存在于肝内胆管，但

6、胆囊内亦可发生。近年来关于胆囊色素性结石的研究已经引起人们的重视，其病理成因比较复杂，至今仍未完全阐明。现代医学观点认为胆色素结石的发病主要与胆道细菌感染、胆汁淤滞和胆道寄生虫病等多种因素密切相关，其中胆道动力学异常和胆汁淤积是生石的重要条件2。目前，临床治疗肝胆管结石多采用手术（肝叶或肝段切除，重建胆管通路）和各种途径（溶石、碎石、取石等）相结合的综合治疗措施，但效果尚未达到理想程度，因此，非手术疗法的研究一直备受重视。目前中医药在肝胆管结石治疗中的优势日显突出。本学科的前期研究工作表明，清胆胶囊和养肝利胆颗粒对胆石病具有肯定的临床疗效3。为进一步论证此两种药物的作用机制，尤其是对胆色素结石

7、的作用，我们进行了以下的研究。1 材料和方法1.1 实验动物 普通级豚鼠，雄性，300350 g，共32只，由上海市奉贤县泰日镇银根养兔室提供，合格证编号为SCXK（沪）20030002。1.2 实验药物和致石方法 清胆胶囊和养肝利胆颗粒为上海中医药大学龙华医院的院内制剂，均由龙华医院制剂室生产提供。清胆胶囊由生大黄、陈皮、虎杖三味中药组成（规格：0.3 g×60粒/瓶；批号：沪药制字Z05170981）；养肝利胆颗粒由白芍、何首乌、枸杞子、陈皮、甘草组成，8 g/包，每克干粉相当于4.5 g生药（批号：沪药制字Z05170982）。    盐

8、酸林可霉素注射液，规格：0.3 g/ml（上海旭东海普药业有限公司，批号：070411）。致石饲料配方4：正常饲料45.43 g和致石性药物（酪蛋白l g、蔗糖1.5 g、猪油l g、微晶纤维素l g、胆酸0.02 g、胆固醇0.05 g）4.57 g（上海斯莱克实验动物有限责任公司）。1.3 动物分组、造模及药物处理 实验豚鼠随机分为空白组、模型组、清胆胶囊组和养肝利胆颗粒组，每组各8只。皮下注射林可霉素60 mg/（kg·d），同时给予致石饲料，连续7 d，建立豚鼠胆囊胆色素结石动物模型4，5。造模期间不限饮食、摄水。空白组喂正常饲料的同时皮下注射等体积生理盐水，连续7 d。清胆

9、胶囊组和养肝利胆颗粒组均于造模前3 d开始给予相应的药物（制备成混悬液）灌胃，药物剂量以成人用药剂量（60 kg体质量，清胆胶囊2.7 g/d，养肝利胆颗粒16 g/d）按实验动物体型系数换算法计算6，清胆胶囊按0.22 g/（kg·d）计算，养肝利胆颗粒按1.28 g/（kg·d）计算，连续给药10 d。空白组和模型组均予等体积生理盐水灌胃。各组灌胃时间均为2次/d，灌胃10 d后取材。1.4 标本采集和制备 各组动物均于第10天灌胃结束后禁食不禁水，次日取材。以15%乌拉坦腹腔麻醉，抽血处死。肉眼观察胆汁中成石情况，抽取胆汁，迅速完整切除胆囊后放于冰盘上，再次仔细观察胆

10、囊内成石情况，随后置于4 预冷的生理盐水中，洗去余血，和胆汁分别于80 冰箱保存备测。1.5 胆石红外光谱定性 采用美国Nicolet公司Mgna FTIR750型红外光谱仪测定胆石成分。1.6 指标测定 胆汁中总胆红素（total bilirubin, TBIL）和游离胆红素（unconjugated bilirubin, UCB）含量用重氮试剂法测定，胆汁中钙离子（Ca2）用甲基麝香草酚蓝比色法测定，试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。1.7 统计学方法 计数资料采用率表示，采用确切概率法检验。计量资料用x±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析。所有运算程序均在计算机上运用S

11、PSS 11.5统计软件包进行。2 结果2.1 豚鼠胆结石生成情况 空白组有1只动物发生胆结石（12.5），模型组8只全部有结石形成（100%），其成石率显著高于空白组（P<0.01）。清胆胶囊组有3只动物成石（37.5%），养肝利胆颗粒组有5只动物成石（62.5%），均明显低于模型组胆石生成率（P<0.01）。2.2 胆石定性 肉眼见胆囊及胆管内有棕黑色泥沙样或棕色絮状沉淀物。经红外光谱检测可见在1 652.7 cm1处有一胆红素吸收峰，在1 033.7 cm1处有一焦磷酸盐吸收峰，为胆红素焦磷酸盐类色素型结石。2.3 各组豚鼠胆汁总胆红素含量 模型组豚鼠TBIL含量明显高于空白

12、组（P<0.01），养肝利胆颗粒组TBIL含量较模型组明显降低（P<0.05）。清胆胶囊组TBIL含量较模型组也降低，但差异无统计学意义。见表1。2.3 各组豚鼠胆汁游离胆红素含量 模型组豚鼠UCB含量明显高于空白组（P<0.01），清胆胶囊组和养肝利胆颗粒组含量较模型组均明显降低（P<0.05）。养肝利胆颗粒组UCB含量低于清胆胶囊组，但差异无统计学意义。见表1。2.4 各组豚鼠胆汁钙离子含量 模型组豚鼠胆汁的Ca2含量明显高于空白组（P<0.01），清胆胶囊组和养肝利胆颗粒组胆汁中Ca2含量较模型均组显著降低（P<0.01）。清胆胶囊组和养肝利胆颗粒组C

13、a2含量比较，差异无统计学意义。见表1。表1 各组动物胆汁总胆红素、游离胆红素和钙离子含量（略）Table 1 Levels of total bilirubin, unconjugated bilirubin and Ca2 in four groups*P<0.05, *P<0.01, vs untreated group.3 讨论    胆色素结石是一成因复杂的疾病，普遍认为是多种因素共同作用的结果，可涉及胆道梗阻与感染，钙离子、黏蛋白、胆汁酸、氧自由基以及脂蛋白代谢障碍等2。本实验采用林可霉素联合致石饲料的方法建立胆色素结石动物模型4

14、，5，分别观察清胆胶囊和养肝利胆颗粒对胆色素结石模型动物生化指标的影响，探讨二者对胆色素结石的防治作用和部分作用机制。    胆色素结石形成的一个必要条件之一是胆汁中UCB和Ca2含量的增加。在生理情况下，胆汁中UCB较少，即使有Ca2存在，也不易形成结石，原因在于胆汁中的胆盐能使UCB离子化，避免其与Ca2接触。当胆汁中UCB含量增加时，便会产生胆红素钙沉淀，成为胆色素结石形成的基础。本研究发现模型组胆汁中UCB、Ca2含量明显增加，与上述理论相吻合。由此可见，模型组成石机制可能就是因为胆汁中TBIL、UCB及Ca2含量的增加，胆红素钙沉淀溶解平衡失调

15、，从而形成致石胆汁，导致成石7，8。本研究发现，清胆胶囊和养肝利胆颗粒均有明显干预动物胆汁生化学变化的作用，该两种药物可能主要通过降低胆汁中UCB及Ca2含量，从而逆转成石性胆汁，较好地预防结石形成。    胆石病根据其临床症状及病理特点归属于中医学胁痛、腹痛或胆胀等范畴，其病因多见于情志失调或饮食不节，致湿热中阻，郁而化热，熏蒸肝胆，煎熬成石。临床上多采用辨病与辨证论治相结合的方法诊治胆石病。本次研究中的实验药物清胆胶囊和养肝利胆颗粒均是本学科依据多年临床经验总结研制而成的药物。清胆胶囊由大黄、虎杖、陈皮等组成，具清除湿热、行气活血、缓下通便和健脾和中

16、之功效。方中大黄清泄湿热、利胆消黄；虎杖清热解毒、利湿、活血，兼缓下通便；陈皮行气，与大黄、虎杖活血作用相配，可奏行气活血之效，以达“通则不痛”的目的。养肝利胆颗粒由白芍、首乌、枸杞子、陈皮、甘草等组成。方中首乌、枸杞子、白芍滋养肝阴；枸杞子生精益气；白芍养血敛阴、柔肝止痛；甘草缓肝急；陈皮理气健脾，且能防滋阴药过于滋腻之弊。现代药理研究认为上述药物在肝胆水平均有显著的药理作用9。两方中诸药合用均能达到阻遏成石性胆汁生成的作用。其现代药理学机制则是通过降低胆汁中UCB和Ca2的含量，保护肝细胞的正常代谢，达到逆转胆汁成石的作用。此外，本研究还发现此两种药物在改善TBIL、UCB及Ca2上的差异

17、均无统计学意义，说明二者尽管中医治则不同，但在干预胆色素结石形成的生化学环节方面，效果及作用机制基本一致。【参考文献】1 Biliary Groups of Surgery, Surgery Academy of China. The trend of the gallstone disease in China over the past decade. Zhonghua Wai Ke Za Zhi. 1995; 33(11): 652658. Chinese with abstract in English.中华外科学会胆道外科学组. 我国胆石病十年来的变迁. 中华外科杂志. 1995;

18、33(11): 652658.2 Guan ZZ, Tang QL. Research progress of formation factors of bile pigment calculus. Heze Yi Xue Zhuan Ke Xue Xiao Xue Bao. 2007; 19(1): 6873. Chinese.关中正, 唐乾利. 胆色素结石形成的因素研究进展. 菏泽医学专科学校学报. 2007; 19(1): 6873.3 Zhu PT, Zhang JZ, Cao ZP, et al. Summary of 274 cases of infection of biliar

19、y tract and cholelithiasis. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi. 1986; 20(9): 1517. Chinese.朱培庭, 张静喆, 曹中平, 等. 治疗慢性胆道感染、胆石病274例的总结. 上海中医药杂志. 1986; 20(9): 1517.4 Xu CS, Zhu PT, Cao ZP, et al. Experimental study of animal model and drug prevention and cure of bile pigment stones. Zhonghua Xiao Hua Za Zhi. 198

20、2; 2(1): 3436. Chinese.徐长生, 朱培庭, 曹中平, 等. 胆色素结石动物模型及药物防治的实验研究. 中华消化杂志. 1982; 2(1): 3436.5 Wang JT, Chen YQ, Niu SK. Effect of free radicle in the formation of bile pigment stones. Shanxi Yi Yao Za Zhi. 1999; 28(2): 116118. Chinese with abstract in English.王俊田, 陈允清, 牛树凯. 自由基对豚鼠胆色素结石形成的影响. 山西医药杂志. 1999; 28(2): 116118.6 Chen Q. The experimental methods of traditional Chinese medicinal pharmacology. Beijing: People's Medical Publishing House. 1