体外转录过程中遇到的问题及探讨_袁红梅

1、第 21卷 哈尔滨师范大学自然科学学报V o. l 21, N o . 32005第 3期NATURAL SCIENCES J OURNAL OF HARBIN NORM AL UN I V ERSITY体外转录过程中遇到的问题及探讨袁红梅 陶 雷 赵丽娟 王同昌(哈尔滨师范大学 【 摘要 】 人们在做原位杂交 、 southe m b l o ts 或 northe m b l o ts 时 , RNA 探针比 DNA 探针稳定且特异性强 1, 产生的讯号比 DNA 探针强约 10倍 , 因此通常 RNA 探针成为实验者的首选 . 本人在用 SP6RNA 聚合酶体外转录合成史氏鲟 B -ac

2、tin 基因的 RNA 探针时 , 转录产物电泳后出现四条带 , 分别位于模板的上端和下端 . 为了探究其 中的原因 , 本人选择了可能影响转录产物长度的几个因素 (RNA聚合酶 、 模板具有 3c -凸头以及模板的长度 分别设计实验进行分析 , 结果发现不同的 RNA 聚合酶以及 模板过短可能形成自连等都有可能影响转录产物的结果 .关键词 :体外转录 ; 史氏鲟 ; RNA 聚合酶 ; 3c -凸头收稿日期 :2005-04-50 引言转录是 RNA 聚合酶以 DNA 为模板合成 RNA 的过程 . 在体外转录时 , 可以将要转录的 DNA 片 段克隆到转录载体的多克隆位点上 , 而在多克隆

3、 位点的附 近应有 SP6、 T7或 T3RNA 聚合 酶的启 动子序列 2. 经凝胶回收纯化的含有 RNA 聚合酶 启动子序列的 PCR 产物也可以作为转录模板 . 在 体外转录过程中 , 有许多因素会导致转录失败 , 例 如模板不纯 , 如模板中带有残留物 (乙醇和盐 会 抑制反应 ; RNA 酶污染 , 所有模板 纯化的方法或 研究人员的操作都可能导致 RNA 酶污染 . 因此 , 在所有的体外转录反应中加入 RNA 酶抑制剂 . 也 有一些因素会导致外转录产物比预计的短 , 例如 , 在模板上出现未确认的 RNA 聚合酶终止位点 ; 在 富含 GC 的模板上导致转录提前终止 , 降低反

4、应 的温度会增加全长体外转录产物的比例 . 还有一 些因素会导致全外转录产物比预计的长 , 例如 , 质 粒模板线化不完全 , 或者模板具有 3c -凸头 , 3c -凸头的线 性模板 , RNA 聚 合酶会延 伸到相 反链上 , 产生带有互补序列的超过目的片段的转录产 物 . (引自 Pro m ega 技术资料中常见问题 1 材料和方法1. 1 实验材料本实验所用史氏鲟采自中国水产科学研究院 鲟鱼繁育技术工程中心 . 1. 2 实验方法1. 2. 1 制备体外转录的模板史氏鲟总 RNA 的提取 采用 T rizo l 试 剂 (I n -vitrogen 公司产品 , 然后根据已发表的鱼类

5、 B -acti n 基因的保守区设计一对引物 B-acti n -L , 5c -TCAGTGAGCAGGACGGGGTG -3;' B -acti n -U, 5-' CGGTTTCGCTGGAGATG -3.'RT-PCR 以 及氏鲟大脑总 RNA (1L g 为模板 , 利用 supercript 反转录酶 (Inv itrogen 公司产品 合成 c DNA 第 一链为模板 , 用 B-acti n -L 和 B-acti n -U 为引 物用 Taq 酶进行 PCR 反应 . 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和 DNA 凝胶试剂盒纯化后 , 与 pGE M -T 载

6、体 (Pro m ega 公司 连接 , 再转化大肠杆菌 , 通过 蓝、 白斑筛选 , 挑取阳性克隆扩大培养后 , 纯化重 组质粒 DNA, 并送上海博亚生物公司进行测序 . 1. 2. 2SP6RNA 聚合酶体外转录合成 RNA 探针 根据测序结果及连接方向 , 以 SP6, 5c -CAT -ACGATTTAGGTGACACTATAG-3' 与 B -acti n -U 为一对引物 , 用 Taq 酶分别进行 PCR 反应 , 扩增 产物胶回收纯化以 PCR 纯化产物为模板 , 取 SP6 RNA 聚合酶 (宝生物公司 进行体外转录 (20L L 体系 合成反义 RNA. 37e

7、温浴 2h 后 , 加 2L L 0. 2M EDTA(pH 8. 0 终止反应 , 加 2. 5L L(0. 1体积 4M L i C l 和 75L L (2. 5体积 预冷 (-15to -25e 乙醇 , 混合 . 置于 -60e 至少 30m i n , 然 后 13000g 离心 15m i n , 倾去乙醇 , 真空干燥 . 转 录产物 溶于 20L L 无菌、 RNase -free 的双 蒸水 中 , 加 1L L RNase I nhibitor , 取 4L L 转录产物凝 胶电泳检测 , 其余立即置于 -60e 以下分 装保 存 .1. 2. 3P f u 酶代替 T

8、aq 酶进行 PCR 反应重复 1. 2. 2步试验 , 以 SP6和 B -actin -U 为一对引物 , 用 P f u 酶代替 Taq 酶进行 PCR 反应 , 扩增产物胶回收纯化 , 以 PCR 纯化产物为 模板 , 取 SP6RNA 聚合酶 (宝生物公司 进行体外转录 (20L L 体系 合成反义 RNA. 步骤同上 .1. 2. 4T7RNA 聚合酶体外转录合成 RNA 探针 根据测序结果及连接方向 , 以 T7, 5c -TAAT -ACGACTCAC TATAGGG-3c 与 B -acti n -U 为一 对引物 , 用 Taq 酶进行 PC 反应 , 扩增产物胶回收 纯化

9、 , 以 PCR 纯化产物为模板 , 取 T7RNA 聚合酶 (Pro m ega 公司 进行体外转录 (20L L 体系 , 合 成反义 RNA. 步骤同上 .2结果史氏鲟 B -actin 的基因片段经 SP6RNA 聚 合酶 (大连宝生物公司 转录后 , 转录产物为图 1中 2泳道 , 转录出四条带 , 分别在近 300bp 、 400多 bp 、 500多 bp 和 600多 bp 处 . 其中位于 300多 bp 处的这条浅带是 DNA 模板 , 在 此转录产物中 加 DN aseI , 37e 温浴 15m i n , 模板条 带消失 . 用 Pfu 酶进行 PCR 扩增 , 扩增

10、产物胶回收纯化后作 为模板进行转录 , 转录产物仍是多条带 , 结果与图 2中泳道相似 . 史氏鲟 B -acti n 的基因片段经 T7 RNA 聚合酶 (Proge m a 公司 转录后 , 转录产物如 图 1中 1泳道 , 只有一条较宽的亮带位于模板下 方 .图 1史氏鲟 B-ac ti n 基因的转录结果F i g . 1B -ac ti n Tran stript i n R es L L tsof Am ur Stu rgeon11T7RNA 聚合酶 的转录结 果 ; 2. SP6RNA 聚 合酶的转 录结果 ; 3. DNA M arker(自上而下依次为 600bp , 500

11、bp , 400bp , 300bp, 200 bp , 100bp1. Transcripti on res L Lt of T7RNA pol y m eras e ; 2. Transcri p tion res L L t of SP6RNA poly m erase ; 3. DNA M arker I . (up to do w n 600 bp , 500bp , 400bp , 300bp, 200bp, 100bp3讨论史氏鲟 B -acti n 基因的 B -acti n -U 与 B -acti n -L 之间的片段长 264bp , 加上 SP6启动子 序列 99bp

12、转录产物应为约 360n t 左右 , 实验中 用的是 DNAM arker , 因此正常转录产物应在位 于约 200bp 的位置 (RNA 为单链 , 分子量应为同 等长度 DNA 分子量的一半 . 从图 1中的结果看 , SP6RNA 聚合酶 (宝生物公司 的转录产物有四 条带 , 有三条比预计的转录产物长 . 本实验的模板 是胶回收纯化的 PC R 产物而不是质粒 , 因此部分 转录结果比预计的长不可能是由于质粒酶切线化 不彻底而导致的 .为了获得确定长度的转录产物 , 应用能产生 5-' 凸头的线化模板 . 在 3c -凸头的线化模板上 , RNA 聚合酶会延伸到相反链上 ,

13、产生带有互补序 列的超过 目的 片段 的转 录产 物 . 用 Taq 酶进 行 PC R 扩增时 , PCR 产物通常在 3c 端多加 1个 A, 形 成 3c -凸头 . 而 Pfu 酶进行 PCR 扩增时 , 90%以 上的 PCR 产物在 3c 端不多加 A, 形成平末端 . 那 么部分转录产物偏长是否是由于用 Taq 酶扩增合 成转录模板时产生 3c 凸 头 , 而使 RNA 聚合酶延伸 到相反链上 , 产生带有互补序列的超过目的片段 的转录产物呢 ? 实验结果表明无论是用 Taq 酶扩 增还是 Pfu 酶扩增合成模板 , 转录产物均是多条 带 , 部分转录产物比正常的长 . 因此 ,

14、 这里的部分 转录产物偏长 并不是由于模板是 3c -凸 头而造 成的 .史氏鲟 B-acti n 基因片段加上 T7启动子与 多克隆位点序列应为 316bp, T7RNA 聚合酶 (Pro -m ega 公司 的转录产物如图 1中的 1泳道 , 模板 下面只有一条带 , 且位于 100与 200bp 之间 , 与 预计的正常的转录产物的长度基本相符 . 由此可 见对 于相 同 的 转录 模 板 , 不同 的 RNA 聚 合 酶 (SP6和 T7 转录效果是不同的 , 这可能是由于这 两种 RNA 聚合酶与模板之间不同的相互作用而 导致的 .本人亦用 T7RNA 聚合酶 (Pro m ega

15、公司 转 录了史氏鲟 sox4基因 (未发表 HMG -box 3的保 守区的两个 DNA 片段 . 这两个 DNA 片段加载体 序列后分别长为 232bp 和 559bp :232bp 片段的 转录产物在 200bp 和 500bp 处各有一条带 ; 559 bp 片段的转录产物只有 200多 bp 处有一 条带 . 而上述 B-acti n 的 300bp DNA 片段的 T7RNA 聚 合酶的转录产物也是正常的一条带 . 由此可见 , 转 录结果似乎与模板的长度也有一定的关系 , 模板 短 (小于 300bp, 模板之间有可能形成自连或其 他原因而导致转录产物偏长 .总之 , 体外转录会

16、受许多因素的影响 , 也还有 更多的影响因素及其作用机制需要我们更深一步 的探究 .参 考 文 献1M elton D . A , et a. l E ffici en t i n vito syn t hesis of b i o l og i call y ac -ti ve con tai n i ng a bact eri oph age SP6p ro m oter . Nu cl eic Acid Res , 1984, SP t . 25; 12(18:70352王建华 , 王德宝 . 用 T7RNA 聚合 酶转录合 成 RNA 片段 :生物 化学与生物物理学报 , 1991,

17、23(6:500505PROBLE M S AND ANALYSIS I N VI TRO TRANSCRI PTI N Yuan H ong m ei Tao Lei Zhao L ijuan W ang Tongchang(Harb i n Nor m alU nivers it yABSTRACTThe sensitivity o f RNA pr obe is about ten ti m es higher than t h at of DNA probe in situ hybri d ization , southern b l o ts o f norther n blots , so RNA probe is prior to be chosen . The transcript has four bands in gel elec -trophoresis as B -acti n RNA probe of Am ur Sturgeon is synthes