近红外双色激光成像系统

1、近红外双色激光成像系统 软件操作指南 （中文版）基因有限公司 2007年3月Odyssey软件操作指南目 录第1章 序言.1如何开始.1 权限.1 ODYSSEY简介.1 红外的优点.1 双色红外染料.1Odyssey检测系统.1 网络连接.1 工程模式（Project Model）.2 分析图像.2下文提示.2第2章 启动扫描.3工程、扫描和分析.3启动扫描.3扫描步骤.3停止扫描.6 在扫描过程中关闭Odyssey软件.6 在NEW ANALYSIS窗口中完成一次扫描.7其他扫描方法.8第3章 创建新的分析.9 TUTORIAL工程中导入图像.9创建新分析.10改变图像外观.11 旋转图像

2、.11 裁剪图像.12打开图像查看.15第4章 定量.16检查设置.16确定浓度标准.17 中心特征.18 大小特征.18 标准品的命名.18 输入标准品的浓度.19采用标准品进行定量.20对未知样品定量.21700通道图形的定量.22使用细节观测进行数据比较.24打印定量报告.24 报告模板.24 iOdyssey软件操作指南打印报告.25 保存工程.25第5章 微孔板网格定量.27输入微孔板指南图像.27打开方格法分析.27应用一个网格模板.28网格表中的数据显示.32网格法定量.32 IN-CELL WESTERN分析.32下文提示.32第6章 条带大小的确定.33总述.33在指南工程中

3、导入图像.33检查设置.34开始一次新的分析.34增加泳道.36 移动和恢复泳道.38 移动泳道.38 改变泳道的宽度.38 增加多个泳道.39编辑条带分子量.41 寻找条带起始端.41 添加和恢复条带分子量.41 删除条带分子量.43 输入每个MW MARKER的大小.45MW线条和MW标样条带的联系.46 调整和移动MW线.46MW线在图片中的应用.47标示标样大小.47生成泳道报告.48 文档输出.49工程保存.50第7章 ODYSSEY面板启动扫描.51启动扫描.51 扫描过程.51 扫描范围.51 文件命名规则.51 查看扫描状态.52 停止扫描.52下载数据并分析.52iiOdys

4、sey软件操作指南第1章 序言如何开始Odyssey软件信息可查阅本手册和用户指南（Odyssey User Guide），涉及到活体成像的软件信息请参考活体成像指南（Odyssey In Vivo Imaging Guide）。本章后面的Odyssey简介也有助于Odyssey的操作。如果需要安装Odyssey或其软件，请参阅Odyssey安装手册（Odyssey Installation Manual）。最近更新的信息请阅读Odyssey CD光盘中的Readme文件。用户指南（User Guide）详细描述了Odyssey软件的全部功能。本操作指南更侧重于完成常规人物的必须操作步骤，如扫

5、描、条带大小、定量。每章都基于前面章节的操作，因此最好从头阅读。权限开始本指南之前，请先确定拥有进入Odyssey的控制权限。管理员用户可设置你的进入权限。启动一个新的扫描、下载数据和分析图象要求具备控制权限。Odyssey简介红外的优点以前可见光谱荧光技术被广泛的应用于蛋白和核酸检测成像。然而大多数成像系统由于在可见光谱内具有很强的的背景荧光，而限制了其对膜上大分子的检测。Odyssey红外成像系统通过采用近红外荧光技术而消除这些障碍。红外光谱具有低背景荧光可提供比可见光谱荧光更高的信噪，而且灵敏度与化学发光相当，但不需要化学发光底物和胶片。双色红外染料Odyssey红外成像系统采用双色染料

6、同时检测。双色检测增加了更多的检测能力。如同一张膜上使用两种不同染料标记的的抗体以检测两种不同的蛋白。Odyssey检测系统Odyssey检测系统采用两个完全独立的检测通道两种染料分别检测。2个二极管激光器分别提供685nm和785nm的光源，2个雪崩式光电二极管经过滤后检测720nm和820nm的荧光。扫描分辨率从21 -337m。关于检测系统更详细的内容请参考Odyssey操作员手册（Odyssey Operators Manual）。网络连接Odyssey可被视为一个扫描系统和文件服务器的组合。安装有Windows（XP/NT/2000/98/95）的电脑可与Odyssey成像系统直接连

7、接，或者电脑和系统都可被接入局域网。接入局域网后灵活性更大，即扫描可被随处启动。安全方案保证用户只能进入被允许的的文件。管理员可改变进入权限。1Odyssey软件操作指南工程模式（Project Model）Odyssey采用工程模式管理您的操作，所有创建的扫描都是一个工程的一部分。工程就是个容器，为相关扫描的分组提供逻辑路径。每个扫描的分析数据也是工程结构中的一部分。如果一个工程被打开，则可在其中启动新的扫描。开始扫描扫描可从Odyssey面板、软件或网络浏览器中启动。如果开启一个扫描，那么扫描参数如扫描区域和分辨率都是指定的，这些参数将被传给Odyssey，以启动扫描和采集数据。每种染料都

8、有一张独立的图像，扫描数据被存储在Odyssey内部的硬盘内。如果用Odyssey软件启动一个扫描，扫描数据将实时自动传输到电脑上。分析图像扫描结束后，通过创建分析条带大小或定量被启动并成为工程的一部分。当分析被打开，扫描后的两幅图片以不同颜色显示。重叠模式让数据比较更容易，因为同一区域内两种荧光重叠以第三种颜色显示。快速简单的工具让图像分析更快捷。软件提供了条带大小和定量工具。如果已购买软件还提供了In-Cell Western模块和MousePOD模块。分析结束后，提供多种可打印的报告格式。下文提示第2章您可学习到如何用Odyssey软件启动一个新的扫描。2Odyssey软件操作指南第2章

9、 启动扫描工程、扫描和分析Odyssey的所有文件都包含在工程中。每一个工程内可包含许多扫描，每个扫描包含一张或两张TIFF格式的图像，取决于使用一种还是两种染料。当一个扫描被分析后，包括分子量大小和定量数据。扫描之后，新的分析窗口被打开创建新扫描文件的第一次分析。一个扫描更多地分析可能因为各种原因而被创建，例如，不同用户的多张膜同时扫描，每个用户能够独立分析图像中的一部分。如果原始图像被翻转或旋转过，新的分析可创建以校正图像的方向。当一阁分析被创建，图像可被翻转、旋转、裁剪、过滤或去除背景荧光。启动扫描有3种方式启动Odyssey扫描：z 仪器面板z 网络浏览器z Odyssey软件Odys

10、sey软件操作见本章。操作面板“一键扫描”请见第7章，浏览器启动扫描请见Odyssey Operators Manual。扫描步骤1） 启动Odyssey软件并选择File New，创建一个新工程。注意：扫描通常会被加入已经存在的工程而不是新建工程。存在的工程可以通过选择File Open打开。2） 设置路径，替换“user name”为Windows用户名。在Name处输入Tutorial作为工程名。（Licor目录可变化，如果需要可通过Browse按钮查找目录）C:Documents and Settingsuser nameMy DocumentslicorOdysseyProjects

11、3） 单击Scan创建新工程并启动扫描，将成为Tutorial工程的一部分。4） 在“Scanner Login”窗口，输入User Name和Password（敏感数据）3Odyssey软件操作指南5） 单击OK打开扫描控制窗口。扫描控制窗口（Scanner Console）可命名扫描和设置重要的扫描参数如尺寸和分辨率6） 在Name处输入FirstScan作为扫描文件名7） 选择扫描Group和User name对应扫描Group就像Odyssey扫描仪上的目录，仅限于特定用户进入8）在Preset的下拉菜单中选择MembranePreset即已保存的扫描参数预设值，如果重复扫描，预设值比

12、逐个输入扫描参数的效率更高。9） 在Description中输入First Tutorial Scan描述包含在分析报告中选择预设值，将自动的载入全部扫描参数。每项扫描参数的简要说明请见下文，完整信息请见Odyssey User Guide。预设值载入后，任何扫描参数仍可被编辑。下一步就是设置Scan Area。z Resolution（分辨率），可设置为21、42、84、169、337m，169m可用于常规的膜、凝胶和孔板扫描z Quality（质量）决定膜上设定区域内有多少检测信号组成图像上的一个像素。Medium较常用z Focus Offset（焦距偏移），若扫膜通常为0，若扫孔板则为

13、3mm，若扫胶则为凝4Odyssey软件操作指南zzzz 胶厚度的一半（最大4mm） 由于孔板从底部扫描，所以如果扫描孔板则选择Microplate（flip image） Channels（通道）选择框用于选择700通道、800通道或二者都有 Intensity（强度）通常扫膜为5.0，DNA凝胶8.0，蛋白凝胶或孔板5.0 Scan Area（扫描区域），通过单击拖曳在网格上画出矩形区域，并由此自动产生Origin和Size的值。扫描区域也可通过手动输入Origin和Size值设定10） 双击扫描网格清除初始的扫描区域。单击网格的左下角，按住鼠标左键拖曳并在网格上画出一个5cm高、20cm

14、宽的矩形，再松开鼠标。网格左下角就是原点(0,0)，表示Odyssey扫描仪扫描面板上的左前角。扫描矩形可在网格任意位置而不必从原点开始扫描重要：扫描区域一般略大于膜或凝胶的面积。11）设置扫描区域后，请注意文件大小每张图像文件大小尽可能在7M以内，最大为14M。见Odyssey User Guide第2章文件大小的详细内容12）如果您没有准备膜，将随机的扫描尺放在Odyssey扫描面板的左下角（如图所示）。注意：放置膜、微孔板和凝胶的注意事项请见Odyssey Operators Manual。箭头顶端表示扫描面板的原点(0,0)5Odyssey软件操作指南提示：扫描矩形膜等，长边沿扫描区域

15、下边界水平放置可使扫描得更快。垂直放置则使激光器的行进距离更远，增加扫描时间13）关闭Odyssey的上盖14）在扫描控制窗中单击Start Scan，把扫描参数传输给Odyssey并开始扫描。 扫描过程中，图像在Scanner Console窗 口中实时同步显示 15）在图像显示之后，单击AlterImage Display，选择LinearManual并增加两个通道的Sensitivity直到可以看到尺子注意：Alter Image Display仅改变图像数据的显示，不同于Scanner Console中的Intensity参数（该参数调节荧光信号的检测）。在Scanner Consol

16、e窗口底部，状态栏中显示扫描所需时间，进度条表示扫描完成比率扫描膜时，如果条带或点比较暗时，在Alter Image Display窗口内用明暗度和对比度。如果没有任何荧光信号显示，则用Linear Manual Sensitivity滑块增加灵敏度。默认情况下，700和800通道图像重叠显示，默认是红/绿色，两个通道重叠荧光信号为黄色。如果需要两个通道独立显示，Alter Image Display窗口中的Show This Image选择框可用于一次仅显示一个通道的图像。注意：Adjust Image Curves按钮也可改变图像的显示，见Odyssey User Guide第11章。停止

17、扫描设定区域内都被扫描后，Odyssey会自动结束扫描并储存图像文件。若需在自动完成之前停止扫描，单击Scanner Console窗口中的Stop按钮、或连续按Odyssey前面板上的Stop键两次。扫描停止后，图像文件关闭并保存，文件可被分析。如果放弃扫描并不保存图像文件，单击Scanner Console窗口中的Cancel，而不是Stop。在扫描过程中关闭Odyssey软件6Odyssey软件操作指南如果以高分辨率扫描需要很长的时间，可在扫描完成过程中关闭Odyssey软件。选择File Exit，切勿通过单击Stop或Cancel关闭Scanner Console窗口。当工程重新被打

18、开时，Odyssey软件会自动从Odyssey扫描仪上下载已经完成的图像文件。在New Analysis窗口中完成一次扫描Odyssey结束扫描后，一个New Analysis窗口被打开显示刚结束的扫描得到的TIFF图像文件。这是，TIFF文件储存在计算机上，与工程在同一个目录（自动传输）。17）分析命名Original Ananlysis18）单击OK保存未改变的原始图像下一章将详述图像的剪切、翻转和旋转等。单击OK保存未作任何改变的图像分析被保存后，可被显示在Odyssey窗口的导航树中。19）单击导航树中的First Scan，显示扫描结束后保存的分析20）双击导航树中的Original

19、 Ananlysis显示图像7Odyssey软件操作指南下一章将描述如何复制图像创建一个新的分析。其他扫描方法本章已经介绍了膜扫描的方法，同样的方法通过在Scanner Console窗口中调节合适的预设值可扫描DNA凝胶和微孔板。扫描微孔板还要求使用一个扫描指南（内含），将微孔板放置在已知的位置，可与Microplate2预设值匹配。更大通量至6块微孔板被同事扫描，选择File Scan Multiple Plates。Odyssey User Guide的第2章和Operators Manual包含更多的单块孔板和多块孔板扫描信息。用MousePOD附件如何扫描3只小鼠的方法请见In Vi

20、vo Imaging Guide的第2章。8Odyssey软件操作指南第3章 创建新的分析在Odyssey窗口左边的导航树中，新的扫描列于指定工程下面。单击正号+，显示加在扫描后的第一次分析。在Tutorial工程练习中，实际上未扫描真实的样品。因此本章第一步就是给Tutorial工程导入一组图像。Tutorial工程中导入图像所需图片保存在Odyssey CD光盘中目录为Tutorial Images，文件名为Q700.tif和Q800.tif。导入图片创建新的分析后，可开始定量分析（见第4章）。1） 选择File Open打开第2章中创建的Tutorial工程。2） 选择File Impo

21、rt Images注意：如果原始扫描文件丢失或被删除，在File菜单中选择Import Images通常导入TIFF格式文件。扫描文件（*.scn）是扫描过程中产生的文件之一，包括TIFF文件存储位置、扫描分辨率等信息3） 输入QuantScan作为新的扫描名，Origin Analysis为分析名。4）单击Browse为700通道选择图片5） 在文件选择窗口，在CD驱动器中文件夹Tutorial Images选择文件名的Q700.TIF的文件，单击Open选择文件800通道图像路径会被自动输入，只要与700通道图像的目录相同并以800.tif为后缀6）单击OK导入两幅图像9Odyssey软件

22、操作指南创建新分析图像现在被保存在Tutorial工程中。不改变原始图像，新分析应该以原始图像的拷贝开始。1） 单击Tutorial工程中的扫描列表QuantScan2） 单击工具栏中的新分析按钮，在QuantScan中创建一个新分析也可通过File New Analysis创建新分析3） 在Name中输入Quant1作为新分析名注意：分析名中请勿使用斜线、冒号、逗号、句号等符号4）Description中输入“Quantification of Q700 andQ800 Tutorial Images”5）确定已选择Original Analysis在Available Analyses列表

23、中选择的分析是新分析的拷贝图像来源，只有当前扫描的10Odyssey软件操作指南分析才会被列入表中6）700和800选择框都被勾选，两个通道的图像才都被导入在新分析窗口的Analysis Images栏中，图像的一部分以两通道重叠形式显示，700通道的荧光显示为红色，800通道显示为绿色，双色重叠以阴影的黄色显示。在tutorial图像中没有荧光重叠。改变图像外观新分析窗口中的Analysis Image栏内的按钮可用于改变图像的外观。Flip和Rotate可改变图像的方向。Subtract和Filter可通过背景去除和锐化改变图像质量。Crop可选取图像的一部分用于分析。Alter Imag

24、e Display可改变明暗度和对比度。注意：Rotate、Subtract和Filter如果使用不当则会改变定量结果（见Odyssey User Guide第4章）尽管指南图像不需要改变，但还是看看这些功能如何工作旋转图像7）单击Rotate按钮旋转图像6）注意：新分析窗口是Odyssey软件中唯一可进行裁剪、旋转、过滤等功能的窗口。一旦单击OK关闭新分析窗口，将成为永久的改变，所以关闭窗口前图片的改变方式至关重要。11Odyssey软件操作指南8）单击Counter-Clockwise按钮，设置角度为90，再单击OK图像若小于90度旋转，可在Free中输入度数，但是请注意，若旋转角度不是9

25、0的倍数时，可因为图像的改变而改变定量结果9）由于本分析中的图像不需要旋转，单击Undo按钮恢复至初始的方向Odyssey软件具有多重撤销功能，连续单击Undo可按照顺序撤销之前的操作。裁剪图像在几张膜同时扫描时，Crop工具可裁剪出每张膜以便独立分析。如图中所示，如果想裁剪出双排点中的前7个点，图像中由于明暗度和对比度的原因还有一些点没有显示出来。裁剪前用Alter Image Display按钮改变图像的明暗度、对比度和灵敏度，以显示所有的点。10）单击Alter ImageDisplay按钮打开调节图像显示窗口12Odyssey软件操作指南11）增加LinearManual Sensit

26、ivity滑块直到所有点可见12）单击OKLinear Manual Sensitivity滑块改变LI-COR 16位TIFF图像，8个不同的灵敏度可用。原始图像的强度范围决定了最适合的零度敏度值。在指南图像中，增加每幅图像的值可看到在最低灵敏度不能看见的点。一般情况下，如果图像上的条带或点不能看见的话，可通过Linear Manual Sensitivity滑块增加灵敏度。若条带仅仅是模糊，可用Brightness和Contrast滑块调节。全部点出现后，即可在新分析中裁剪每个通道的前七个点。13Odyssey软件操作指南13）在700（红）和800（绿）通道前7个点画出选择框。单击图像左

27、上角，按住鼠标左键，拖曳至图像底部第7排点右边，再松开鼠标提示：一般裁剪时不需要图像边缘的空白部分。如果图像被剪切的太近，Odyssey软件将显示不同的标签提示。14）单击Crop裁剪出选择框内的图像15）单击OK为新裁剪的图像创建新分析14Odyssey软件操作指南打开图像查看新分析创建后将被加入导航树中所属的扫描下面16）双击导航树中的Quant1分析打开图像17）选择 File Save保存Tutorial工程如果在新分析中图像第一次被打开，两个通道的图像以重叠方式显示。图像查看打开后，需要确定浓度标准。下一章将描述指南图像如何定量。如果现在停止操作，下次可通过打开Tutorial工程并双击Quant1分析重新恢复。 图像查看打开时，工具栏内的很多工具都被激活，可以开始分析了15O