血液中蛋白质的分析与应用

1、血液中蛋白质的分析与应用SC08003034 闫晓辉 3系1. 发展脉络1.1 引言说道体液，首先想到的是血液。人体内的各部分组织器官彼此间有着极微妙的协调作用，其中之一就是有维持血液充分的功能，因此，当其成分逾越常态时，人体会产生异常变化，也就是一般常发生的发烧、酸痛等生病现象。而血液与健康及年龄有密切的关系。血液的成分不足或遭到污染（如饮食不当、空气不洁等），会使各部分组织器官得不到充分的营养，自然容易产生各种病变，这也是现代病剧增的主要原因。蛋白质是以氨基酸的形态从肠壁中被吸收而融入血液里，再被运送到肝脏中，然后被肝脏同化或合成为血清蛋白。其余的就自肝脏放出成为血中氨基酸而送到全身各组织

2、中。1.2 必要性通过研究血液中的蛋白质可以破解人体内的秘密。美国西北太平洋国家实验室发表在分子与细胞蛋白体期刊的一篇论文指出，该实验室成功地掌握了人类血液中的蛋白质。领导该实验室的博士指出，分析了解血液中含有的蛋白质，可以破解许多身体内的秘密，像那些极度活化、濒死的，甚至癌化的细胞，都会因为分泌出蛋白质，泄漏行踪。该实验室先前使用二维电泳的方式来确定蛋白质，不过总会遗漏那些极微量而又带有重要讯息的分子，因此研究团队进一步利用层析仪及质谱仪的协助，有效地去除血液中大量的杂质蛋白，相对放大了极少量带着重要讯息的蛋白质，因此侦测的灵敏度可以到达皮克。研究人员指出，一旦了解血液中所有蛋白质的状况，就

3、等于掌握了身体健康情形，甚至可以预测疾病的发生以及治疗的成果。 检测癌症Science Applications International Corporation-Frederick 公司(SAIC)的研究人员利用传统技术，开发出一种新的方法，可鉴定血液中微量的蛋白质。这种技术提供可以经由鉴定血液中微量的分子而检测某些疾病，如癌症、传染病、行为疾病、发育缺损和神经退化性疾病。这些分子也有助于卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌的早期检测和治疗。人类血清中含有大约10000 种蛋白质，以前由其它科学家进行的研究发现血液中的蛋白质与疾病状态有关。这个新方法将可以灵敏地鉴定疾病标志。 日本东京大学医学研究所最

4、近开发出一种通过验血发现肺癌的新方法，精确度高达80。研究人员发现癌细胞表面生长着特殊的蛋白质，蛋白质的一部分脱落以后会混入血液。研究人员以这种蛋白质为标识，化验了500名肺癌患者和72名健康人的血液，结果肺癌的诊断精确度达到63。研究人员进一步利用肺癌患者和大肠癌患者血液中都含有的一种蛋白质进行检验，肺癌的诊断精确度可以提高到80。肺癌初期症状并不明显，即使利用最新的CT检查，也很难发现很小的病灶，因此患者被确诊肺癌时，往往已经发生癌细胞转移。研究人员认为，如果这种新的肺癌诊断方法得到普及，那么将会大大降低肺癌死亡率。研究人员计划利用这一成果开发小型的肺癌检测装置，在一两年内投入实用。 检测

5、心脏病匹兹堡大学的Trevor Orchard教授等人研究发现，血液中adiponectin含量降低，可能增加第一型糖尿病患者患心脏病的风险。研究显示，adiponectin与过胖、胰岛素抗性有关，此抗性则为心脏病的风险因子。Orchard教授说，adiponectin为人类血浆内最多的循环蛋白质，其也可能具抗发炎的特性。研究人员发现，第一型糖尿病患者体内的adiponectin含量降低与CAD(冠心病，coronaryarterydisease)风险增加有关。TinaCostacou博士说：“此影响与抽烟、胆固醇、或体重等传统因子并无相关；且其预测心脏病时，比起发炎、胰岛素抗性、或是其它因子

6、等指针的效果都好。”此研究共分析28例CAD患者与34位健康者的血样。结果发现，女性样本的adiponectin含量平均为每毫升中20.8微克，男性则为16.5微克，具有显著差异。不考虑性别差异时，每毫升血浆中增加6.3微克adiponectin，能降低63%的CAD风险。Orchard博士说：“虽然所分析的样本较少，但此研究显示adiponectin不仅将能做为心脏病风险分析的指针，也能做为部分高风险患者的预防治疗目标。” 检测艾滋病日本早稻田大学教授松本和子与京都大学副教授田代启等人开发出一种新检测技术，通过测量某种蛋白质在血液中的浓度，即可判断出艾滋病毒的数量，确定病情恶化的程度，精确度

7、是现有检测技术的1000倍。如果感染上了艾滋病病毒，体内一种名叫“SDF-1”的蛋白质就会数倍乃至数十倍地增加，病毒数量越多，这种蛋白质也就越多。因此“SDF-1”在血液中的浓度就成了艾滋病病毒数量变化的晴雨表。 诊断恶性胶质瘤许多种类的细胞都可释放微泡用于细胞间的信息交流。有几种类型的肿瘤细胞可释放含有蛋白质的微泡，改变细胞外的环境以有利于肿瘤的生长。目前，研究者通过检测恶性胶质瘤释放到血液中的含有蛋白质的微泡，可诊断这种恶性度很高的脑部肿瘤。研究者分析了25例恶性胶质瘤患者的肿瘤组织和血清标本。肿瘤组织释放的微泡中的RNA可反映肿瘤细胞各时期的转录信息，有助于研究肿瘤的进展和肿瘤对治疗的反

8、应。以往需通过侵入性操作来进行相关检查，现在非侵入性的血液检测则更为方便和准确。如研究中有2名受试者的肿瘤组织样本没有发现表皮生长因子受体的变异，而血液微泡分析则有所发现。由于微泡包含真实、完全的转录信息，可有望用于所有的肿瘤基因分析以帮助早期诊断和个体化治疗。1.3 分析方法 主要蛋白质分离技术.1 双向凝胶电泳（2-DE）双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方 法。分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复

9、性。在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出34千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点，这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。80年代开始采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。由于可以建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率。此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10100kD分子量的

10、蛋白质。其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的还是用同位素标记，20ppm的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，去除纵向和横向的曳尾以及背景底色，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即所谓“参考胶图谱”。蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量的分析。最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析，确定它们是已知还是未知蛋白。现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组

11、成分析，也可先做45个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。有文献报道，N末端4个残基序列的数据就可以给出很多的信息而得到相当准确的结果。如再结合C末端序列，判断结果的准确性会更高。对分离得到的蛋白质作进一步的确切鉴定需要有足够数量的纯蛋白，电泳时蛋白质已经过了高度纯化。现在一块胶板可允许上到高达mg数量级的样品，因此每个分离的蛋白斑点可有g数量的蛋白，这样使本来是微量的蛋白也可希冀被鉴定。蛋白质的翻译后修饰和加工，是指在肽链合成完成后进行的化学反应，如磷酸化、羟基化、糖基化、二硫键形成，以及最近发现的蛋白质自

12、剪接等等，可能有一百种以上。翻译后修饰和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的，它们的变化往往和疾病的发生有关。用双向凝胶电泳可以进行翻译后修饰的研究，如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化。双向凝胶电泳中常可发现的蛋白质拖曳现象，很可能是一个蛋白的不同翻译后修饰产物所造成的。拖曳图像变化在疾病诊断上可能提供重要的信息。双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是：(1)低拷贝蛋白的鉴定。人体的微量蛋白往往还是重要的调节蛋白。除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外，最有希望的还是把介质辅助的激光解吸/离子化质谱用到PVDF膜上，但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。(2)极酸或极碱蛋白的分离。(3)极

13、大（200kD）或极小（10kD）蛋白的分离。(4)难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白。(5)得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术，因此迫切需要自动二维电泳仪的出现。.2 “双向”高效柱层析“双向”高效柱层析，实际上是先进行一次分子筛柱层析，再进行利用蛋白质表面疏水性质进行分离的反向柱层析。第二次分离的原理与双向电泳中利用蛋白质等电点分离完全不同，两种方法可起补充作用。和双向电泳相比，“双向”高效柱层析的优点是可以适当放大，分离得到较多的蛋白质以供鉴定。另一个优点是流出的蛋白峰可以直接连通进入质谱进行测定，避免了“印迹”的步骤及其缺点。 主要的蛋白质鉴定技术.1 Edman降解法

14、测N端序列尽管Edman降解法测序速度较慢，费用偏高，灵敏度也不如快速发展的质谱，但它测定的肽序列非常准确，成为蛋白质可靠鉴定的重要依据。最近，应用细径（内径0.8mm，流速40L/min）的HPLC柱，Cordwell等能够在100fmol的初产率下测得510个氨基酸残基的序列。Gooley等设计一种称为“sample cartridge carousel”的硬件，能自动地将样品输入序列仪，可进行样品平行测序，加快了测序进程，也降低了费用。随着Edman降解法在微量测序和速度等技术上的突破，它在蛋白质组研究中可发挥重要作用。类似Edman降解法的C端化学降解法研究多年并有自动化仪器问世，但它

15、的反应效率低，通常需nmol样品。.2 质谱技术质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间的荷质比（m/e）的差异来分离并确定分子量。其原理并不新鲜，但是在80年代早期出现的两种新的离子化技术，使质谱从仅能分析小分子挥发物质到可以研究生物大分子，80年代末又发明了两种更新的离子化技术，一种是介质辅助的激光解吸/离子化（matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI），另一种是电喷雾离子化（electrospray ionization，ESI）。这些技术能快速而极为准确地测定生物大分子的分子量；再结合各种新的质谱分析技术，便可以在各

16、种水平上研究蛋白质，为蛋白质研究开辟了新的道路，是蛋白质组研究从蛋白质深入到高级结构研究，以及各种蛋白质之间的相互作用研究。另外，对于蛋白质和多肽，质谱的发展还有一个重要的用途是肽的测序。这是采用串联质谱（Tandem-MS），即在第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂，形成一系列离子，即N端碎片离子系列（B系列）和C端碎片离子系列（Y系列），将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。最近，Wilm等应用纳喷串联质谱（nano-electrospray tandem mass spectrometry）能在较低的fmol量上测得肽段

17、序列。在MALDI-MS方面，近年来可用源后衰变-基质辅助激光解吸离子化质谱（post-source decay MALDI-MS，PSD-MALDI-MS）技术测得肽序列。与上述方法测肽序列不同，Chait等发展一种称为“protein ladder sequencing”的方法，通过对Edman降解法的修改，产生一系列截去N端残基的肽段，用MALDI-MS测得这些肽段的质量，从而推测N端序列。Patterson等利用羧肽酶Y酶解法并结合MALDI-TOF MS质量分析法同样测得了C端得肽序列。Mann等用串联质谱技术分析肽段可得到这样的信息：N端段质量、C端段质量和中间少数几个残基的序列，

18、称为“肽序列标记”（peptide sequence tag，PST），并认为这样的标记比部分肽序列信息在查库时更具限制性。质谱法有不少优点，还能用于翻译后修饰的分析（糖基化、磷酰化），但目前只适用于20个氨基酸以下的肽段。此外，还存在固有的局限性，譬如Leu和Ile、Lys和Gln不能区分，有些肽的固有序列不能用质谱法测定。 高通量检测新技术由于血液中某种蛋白质的浓度异常可以被视作疾病发作的征兆，所以不论是医生还是病人都希望能有一种便宜而迅速的蛋白质检测方法。但根据现有技术，血样需要送到专门的实验室进行分析，一次又只能检查血液中上万种蛋白质中很小的一部分，既耗时又费钱。所以，高通量检测技术的

19、研制非常必要。1.3.3.1 蛋白质芯片蛋白质芯片是一种高通量的研究方法，能在一次实验中提供相当大的信息量，使之能够全面而准确地研究蛋白表达谱，这是传统的蛋白研究方法无法做到的。蛋白质芯片的灵敏度高，检测水平已达纳克级。蛋白质芯片具有高度的准确性。现在应用最广泛的是蛋白质芯片表面增强激光解吸离子化质谱技术即SELDIT0FMS，这种新型蛋白芯片与以往的蛋白芯片不同之处：SELDITOFMS是在MALDI(matrixassisted laser desorptioninionatio)基础上，改进后实行表面增强的飞行质谱。SELDITOFMS 优于MALDIT0F表现为它不会破坏蛋白质，或使样

20、本与可溶的基质共结晶来产生质谱信号。对SELDITOF来说，可以直接将血清、尿液、组织抽取物等不需溶解、染色等处理，直接点样检测，由于一部分非特异结合的分析物被洗去，因而出现的质峰非常一致，有利于后期分析。对于不同的样本，根据检测的目标采取或者设计几种芯片，理论上可以把所有的相同性质蛋白质捕获，但是实际上仍有少量的分子没与表面探针结合。使用SELDITOFMS，仅能给出蛋白质的分子量，不能给出C端、N端的序列，也没法知道蛋白质的构型。另外，在国内，该芯片费用较高，分析质谱需要大量后续工作支持。不难看出蛋白芯片高通量、自动化、灵敏度高和可用于多元分析等优点使其在疾病的机理研究、临床的诊断、疗效的

21、监测方面有巨大的应用价值，虽然蛋白芯片技术还处在起步阶段，有很多的不足，但随着技术的逐渐的成熟，成本的不断下降，必定有广泛的应用前景。1.3.3.2 生物光盘美国普渡大学的大卫·诺尔特领导的研究小组正在研制一种可用来检测蛋白质的廉价诊断工具。这位物理学教授说：“我们已经为生物光盘的概念申请了专利，它是一种灵敏、快速的生物分子传感器。”普通光盘一般被用来存储数字信息，光盘表面的小坑以“0”或“1”的形式记录下电脑数据或音乐，这些微小的小坑被蚀刻在一圈圈圆形的轨道上。现在，研究人员把这些小坑改造成了微型的试管，让每一个小坑中都含有能与血液中特定蛋白质发生反应的微量化学物质。尽管光盘上每一

22、个小坑的直径只有几微米，却可以容纳大量的检测分子，而每一个分子都能与一个待测蛋白质分子配对。通常血液中含有上万种医生需要检测的蛋白质，而一张光盘上的上万条轨道正好可以与各种不同的蛋白质一一对应。科学家首先在每一圈轨道上的小坑里涂抹上一层不同的蛋白质，再把一滴血清样本滴到生物光盘表面，这样就可以用与普通光驱类似的技术来读取信息。不过科学家这时读到的不是数据，而是每条轨道上特定蛋白质的聚集程度。要成为理想的医用检测装置，不仅要能够检测出蛋白质是否存在，还必须具有检测蛋白质浓度的能力。因为从理论上来说检测分子会沉淀在坑的表面，光盘在检测时必须具备很高的灵敏度。如果检测分子浓度很高，其中一部分就会被挡

23、在后面无法与样本配对，而如果检测分子浓度很低，又只能形成很少的配对。在研究人员最近的一次试验中，生物光盘的灵敏度已经可以达到每毫升l0毫微克，一次能够同时检查1万多种物质。这一数据表明它已完全达到了我们对生物光盘的要求。诺尔特认为，相比于另一项检测技术生物芯片，生物光盘在被检测分子的种类上更具优势，而且它也更方便、更便宜。诺尔特说：“目前已经有多种检测技术，其中最先进的检测技术至少需要5万美元，却还有多种蛋白质不能检测。生物光盘可以利用现有的技术，这样光盘与光驱制造成本都不高，而所需的生物化验改造也并不困难。”在技术改造上，只需去除普通光盘上的丙烯酸涂层，让光盘的轨道暴露在外，再让检测分子分别

24、附着在不同的光盘轨道上就可以了。尽管生物光盘的前景看好，诺尔特却认为它在短期内还无法上市。“还要做很多工作来完善工艺”，他说，“即使一切顺利，至少也还需要l0年时间，生物光盘才能出现在医生的手上”。2. 重要文献标题: Quantitative, multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution 作者: Keshishian H, Addona T, Burgess M, et al.来源出版物: MOLECULAR

25、& CELLULAR PROTEOMICS 卷: 6，期:12，页:2212-2229，出版年: DEC 2007 被引频次: 443. 创新突破口3.1 建立评价体系人类血清中含有大约10000种蛋白质，数量非常大，并且与疾病状态有很大的关系。个人认为建立一套完整的评价体系对疾病检测会是非常有用的。首先完善各种蛋白质的测定数据，然后与临床医疗相结合，总结出疾病与蛋白质种类和含量异常的关系。如前所述，血液中adiponectin含量降低，可能增加第一型糖尿病患者患心脏病的风险；“SDF-1”在血液中的浓度是艾滋病病毒数量变化的晴雨表；血液中一种名为“CRP”的蛋白质水平较高的患者，其结

26、肠癌的发病率比其他患者要高出2.5倍；annexin1、14-3-3和LAMR1三种蛋白质可以“提早”显现肺癌，比癌症症状显露时间早大约一年。了解了血液中所有蛋白质的状况，就等于掌握了身体健康的情形，甚至可以预测疾病的发生以及治疗的成果。3.2 改善检测方法如前所述，双向凝胶电泳分辨率高、重复性好、灵敏度高，但是也面临着挑战，如：低拷贝蛋白的鉴定、极酸或极碱蛋白的分离、极大（200kD）或极小（10kD）蛋白的分离、难溶蛋白的检测等。和双向电泳相比，“双向”高效柱层析的优点是可以适当放大，分离得到较多的蛋白质以供鉴定。另一个优点是流出的蛋白峰可以直接连通进入质谱进行测定，避免了“印迹”的步骤及

27、其缺点。两种方法可起补充作用。Edman降解法测定的肽序列非常准确，但是测序速度较慢，费用偏高，灵敏度也不如快速发展的质谱。质谱从小分子挥发物质到生物大分子均可以分析，离子化技术能快速而极为准确地测定生物大分子的分子量，再结合各种新的质谱分析技术，便可以在各种水平上研究蛋白质，为蛋白质研究开辟了新的道路，是蛋白质组研究从蛋白质深入到高级结构研究，以及各种蛋白质之间的相互作用研究。质谱还可用于肽的测序。质谱法有不少优点，还能用于翻译后修饰的分析（糖基化、磷酰化），但目前只适用于20个氨基酸以下的肽段。此外，还存在固有的局限性，譬如Leu和Ile、Lys和Gln不能区分，有些肽的固有序列不能用质谱法测定。蛋白质芯片是一种高通量的研究方法，能在一次实验中提供相当大的信息量，使之能够全面而准确地研究蛋白表达谱。蛋白质芯