副溶血性弧菌标准的检验方法

1、1副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物 和鱼贝类中的海洋性细菌， 为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一， 尤其是在夏秋季 节的沿海地区， 经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品， 引起爆发性食物中毒。 在 非沿海地区， 因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。 为保障食品卫生质量和食用 安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。第一节 副溶血性弧菌标准的检验方法一、检验方法（一）操作步骤1.分离培养：首先称取样品25g,加225mL3.5%灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂

2、平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37C816h培养后，涂上述平板进行分离，37C培养1824h取出观察，挑取可疑菌落，转 种3.5%氯化钠三糖铁斜面，37C、24h观察结果。2.涂片镜检： 将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄 （葡萄糖产酸不产气） 、上层斜 面不变（乳糖、蔗糖不分解） 、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。3.嗜盐性试验： 将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0%，3%，7%，10%）于37C24h培养后观察生长情况，在无盐和10%盐的胨水中不生长，在3%和7%盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。4.生化试验：分别接种下列各类生化培

3、养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37C培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。5动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5%氯化钠胨水，经37C、1618h培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察23d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。（二）检验程序图6-1副溶血性弧菌检验程序二、结果分析判定及注意事项（一）样品处理采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器， 以无菌手续取有代表性的样品， 样品必须尽 快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，

4、在 寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。对采取的样品有时因受存放条件的影响（如低温冷冻或干燥时间过长等原因），使菌体处于受伤状态， 故需对此类可疑食品或可疑中毒材料进行增菌培养， 但应注意为有利于细菌 恢复，不宜选用抑制性较强的培养基，否则影响细菌生长。样品经增菌816h后，转种平板进行分离，挑选可疑菌落，接种于含有3.5%盐的三糖 铁培养基， 此时挑选数目不应少于5个， 尤其夏季海产食品混放， 相互污染严重， 时有不同 型别的大量细菌存在，以防漏检。（二）形态与染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌，易呈多形态，有棒状、弧状、卵圆状、球状、丝状等，排列 不规则，多数散2在，偶而有成

5、对排列，一般大小为0.30.7umK12um,单端一根鞭毛，有动力，运动活泼，两端浓染，在固体培养条件下能生长周鞭毛。（三）培养特性在普通琼脂培养基和普通液体培养基中都可生长，在无盐的条件下不生长，在含2%3%氯化钠的培养基中生长最旺盛，氯化钠溶液浓度到达10%以上时不繁殖。在肉汤和胨水等液体培养基中混浊生长，需氧性强，常在液体表面形成菌膜，在液体培 养条件下菌体多生长为单鞭毛，运行活泼。在固体培养基上，菌落常为隆起，圆形，稍混浊 不透明，表面光滑，湿润，不产生色素。在比较新鲜湿润或软琼脂培养基上，有些副溶血性 弧菌可形成不规则菌落或片状扩散生长，在0.7%以上琼脂的培养基上能生长周鞭毛（侧毛

6、）。一般在2025C培养生长的周鞭毛较为稳定，而在37C培养或24h以上的培养物，周鞭毛易于由菌体自发脱落，具有周鞭毛的菌株， 在固体培养基上多表现扩散生长，单鞭毛的菌株在固体培养基上呈典型菌落，不表现扩散生长。培养基的成分、种类、温度、湿度等条件的不同，都能对扩散生长有所影响，菌落形态 也容易受条件的影响有所改变，如在嗜盐性平板上一般生长良好，而在SS琼脂平板上多呈较小的扁平菌落，不易挑起。在血平反上生长快可出现溶血环，在BCBS（硫代硫酸盐，柠檬酸盐，胆盐，蔗糖）和氯化钠蔗糖琼脂平板上，呈淡蓝或蓝绿色菌落。一般由腹泻病人初 期分离者多为典型菌落，长期保存的细菌或条件不适宜时，常有菌落变粗糙

7、，形状不整齐或菌落出现解离，有的在液体培养时呈沉淀生长现象。pH生长范围为510,最适pH为7.28.2，发育最适温度为3037C。（四）生化特性本菌对葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖和蔗糖，能分解甘露醇，产生靛基质，不产生硫 化氢，甲基红阳性，V-P阴性，赖氨酸阳性，精氨酸阴性，鸟氨酸多数为阳性少数呈阴性， 溶血性多数阳性，有少数不溶血，主要生物化学性状见表6-1。近年来由于细菌学基础研究的深入和检验技术的进步，逐渐对一些海水来源的嗜盐性弧菌有所认识，对其主要生化学性状与副溶血性弧菌的比较见表6-2。表6-1副溶血性弧菌的主要生物化学性状项目项目耐盐性甲基0%红7%V 卜 p10%靛基质葡萄糖产

8、酸赖氨酸+葡萄糖产气鸟氨酸+/蔗糖精氨酸甘露醇溶血性+/硫化氢注：+阳性；阴性；+/-多数阳性，少数阴性。表6-2副溶血性弧菌与其他弧菌的鉴别3注：+90%以上为阳性；一90%以上为阴性；（+ ）迟缓阳性；d 11%89%为阳性； （d）1189%迟缓阳性。（五）溶血性试验我妻氏用高盐血琼脂培养基，在限定的条件下培养副溶血性弧菌时出现的溶血反应，称此溶血性能为“神奈川现象”。此试验要求是用人或兔的新鲜红血球制备高盐血平板，经37C、24h培养，如在单个菌落周围呈现透明溶血环或在菌落下面有明显溶血者，为“神奈川现象”阳性， 若不出现透明溶血环或无明显溶血者，为“神奈川现象”阴性。有致病性的副溶血

9、性弧菌，多数为神奈川现象阳性，但亦有少数为阴性。（六）动物试验经上述检验的可疑菌株，用小鼠测定毒力，将1618h的蛋白胨水或肉汤培养物，注射小鼠腹腔0.30.5mL，有毒力者可在510h发病死亡，长者有24h左右发病死亡。发病时有 竖毛、运动不活泼，腹部紧贴罐底，呼吸困难，四肢抽搐、尾部痉挛震颤等症状。将死亡小 鼠解剖后，取心血等内脏进行分离，可检出试验菌的纯培养。对照动物观察23d无异常现象。但应注意，尚有一些溶藻弧菌也可引起小鼠死亡，有时不易区别，需要上述毓的检验后, 进行毒力证实，综合判定结果。氧葡赖精鸟靛明v菌名化 萄 糖氨氨氨基胶 液 ！糖酶产 气曲厶酸酸酸质化P06810甘阿甘鼠B

10、硝乳 蔗肌泳露拉伯露李半乳酸盐胨糖醇动醇糖糖糖糖苷盐v.fluialis创伤弧菌v.Vuln ificus梅氏弧菌v.metschnikouii霍利斯弧菌v.hollisaev.damseladd+dd)(+dd)(dd+d)(+d + +dd+ +d d+d+d+d+ +d dd+ +d+副溶血性弧菌v.parahaemoly-ticus溶藻弧菌v.alginolyicusOi霍乱弧菌v.choleraeo1非 Oi霍乱弧菌v.cholerae nonoi拟态弧菌v.mimicus河弧菌4pH8.7制法： 除结晶紫和琼脂外,其他按上述成分配好,校正 加结晶紫溶液,分装烧瓶,每瓶100mL。（

11、四）3.5%氯化钠三糖铁琼脂pH9.0培养基成分：蛋白胨20g氯化钠40g制法：除结晶紫外其他按上述成分配好，加热溶解，约加正pH,加热煮沸，过滤，再加入结晶紫溶液，混合分装试管，3%氢氧化钾溶液4.5mL,校121C高压灭菌15min。（二）氯化钠蔗糖琼脂成分：蛋白胨10g牛肉膏10g氯化钠50g蔗糖10g琼脂18g0.2 %溴麝香草酚蓝溶 20m液L100蒸馏水0mLpH7.8过滤,加入指示剂,分装烧瓶100mL,121C高压灭菌内加入蔗糖1g,加热溶化，冷至50C倾注平板。（三） 嗜盐菌选择性培养基成分：蛋白胨20g氯化钠40g琼脂17g0.01 %结晶紫溶液5mL蒸馏水100pH,加入

12、琼脂，加热溶解，15min备用。临用前在100mL培养基pH,加入琼脂，加热溶解，再一）氯化钠结晶紫增菌液0mL5成分：蛋白胨20g牛肉膏5g乳糖10g蔗糖10g葡萄糖1g氯化钠35g0.2硫酸亚铁铵g0.2 硫代硫酸钠g琼脂 12g0.0 酚红25g100 蒸馏水0mLpH7.4制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH,加入琼脂，加热煮沸使琼脂溶化，加入0.2%酚红溶液12.5mL,摇匀，分装试管，121C高压灭菌15min，放置高层斜面备用。（五）氯化钠血琼脂（我妻氏培养基）成分：酵母膏3g蛋白胨10g氯化钠70g磷酸氢二5g甘露醇10g0.0结晶紫01g琼脂15g100蒸

13、馏水0mL制法：调pH8.0，加热30min（不必高压），待冷至45C左右时，加入新鲜人或兔血 （5%10%）,混合均匀,倾注平皿。（六）嗜盐性试验培养基成分：蛋白胨2g 按不同量氯化钠加入蒸馏水100mL6七）3.5氯化钠生化试验培养基成分：牛肉膏5g蛋白胨10g氯化钠35g磷酸氢二钠2g0.2 溴麝香草酚蓝溶 12m液L100蒸馏水pH7.7制法：将上述成分配好后，根据所需的糖发酵管分别加入各种糖类， 葡萄糖发酵管可按0.5%葡萄糖加入后，分装有小倒管的试管内，121C高压灭菌15min。其他培养基可分装为 每瓶100mL，121C高压灭菌15min，另将各糖类分别配好10%溶液，同时高压

14、灭菌后，取5mL糖液，加入100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。（八）葡萄糖食盐胨水（MR-VP试验用）5成分：多胨g5葡萄糖g磷酸氢二 5钾g3氯化钠0g制法：加入1000mL蒸馏水，振摇加热，使全部溶解，冷却后分装小试管，121C高压灭菌15min。（九）食盐胨水（靛基质试验用）成分：蛋白胨20g氯化钠30g蒸馏水1000mLpH7.4制法：按上述分配制，分装小试管，121C高压灭菌15min。（十）运动性试验培养基成分：牛肉 3膏gpH7.70mL70g氯 3化钠0g琼 4脂g制法：将全部成分加入1000mL蒸馏水，加热溶解，分装试管，121C15mi n高压灭菌, 最终pH7.4。

15、第二节 副溶血性弧菌参考检验方法一、日本食品微生物检验方法（一）分离、菌数测定图6-2分离、菌数测定程序（二）鉴定将TCBS平板上生长典型或可疑的菌落挑取2个以上，接种以下培养基:图6-3鉴定程序（三）检查用培养基1. 3%氯化钠蛋白胨稀释液： 蛋白胨10g、 氯化钠30g溶于1000mL蒸馏水中， 校正pH7.0,121C15min高压灭菌。2. TCBS成分：酵母膏蛋白胨蔗糖硫代硫酸钠 柠檬酸钠牛胆酸钠5 牛胆汁粉g白胨5g10g20g10g10g81 氯化钠0g1 柠檬酸铁g2溴麝香草酚蓝（ 2溶液）0mL4 草酚蓝（ 1溶液） mL1 琼脂5gpH8.6制法：将上述成分加蒸馏水至lOO

16、OmL,混合，使全部溶解，校正pH为8.6，加热煮沸, 不需高压灭菌，倾注平皿1520mL。不分解蔗糖的副溶血性弧菌， 在此培养基上生长呈蓝绿色菌落， 分解蔗糖的细菌呈黄色 菌落。3.我妻氏琼脂（改良）培养基5 成分：酵母膏g1蛋白胨0g7 氯化钠0g5 甘露醇g1结晶紫（ 0.1 酒精溶液）mL1琼脂5g制法：将全部成分溶于1000mL蒸馏水中，调正pH为7.5，至完全溶解后，加热煮沸数分钟，不需高压灭菌，冷却至50C时，加入洗净的20%浓度的人红血球悬液100mL混合均匀后倾注平皿。红血球悬液的制备：将人的脱纤维血液，离心沉淀的血球， 用0.85%灭菌生理盐水洗3次，最后沉淀的红血球，用生

17、理盐水制成1:4的悬液。4.亚硫酸铋肉汤成分：蛋白 1胨 0gpH7.49酸铋溶液100mL及95%酒精ImL,混匀，无菌手续加入灭菌试管，每管100mL,不需加热。亚硫酸铋溶液配制： 热水100mL加亚硫酸钠20g;热水100mL加柠檬酸铋铵0.1g；将加溶解甘露醇20g，煮沸1min，最终成白色混浊的混合物， 使用前摇匀。于冷库贮 存，可使用1个月。5.食盐碳水化合物肉汤基础液2成分：蛋白胨g2硫酸钠.5g5氯化铵g0磷酸二氢钠.5g1磷酸氢二钠.5g0.2 %溴麝香草酚蓝溶 1液2mL制法：将全部成分溶于1000人工海水中，分装试管，每管5mL 121C15min高压灭菌， 冷却后分别加

18、碳水化合物10%灭菌溶液0.5mL。碳水化合物溶液需过滤或115C10min高压 灭菌。人工海水的配制：氯化钠23.4g，氯化钾0.66g，硫酸钠3.91g，重碳酸钠0.19g，氯化 镁4.96g，将上述全部成分溶于1000mL蒸馏水。6.Hugh-Leifson食盐培养基成分：蛋白胨2g氯酸钠30g0.3 磷酸氢二钾g葡萄糖10g琼脂4g0.2 %溴麝香草酚蓝溶12m液L100 蒸馏水0mL制法：将上述成分溶解，调pH后加指示剂，分装试管，每管3mL,121C高压灭菌15min。 试验方法：穿刺接种两种，一管加矿物油覆盖表面，于3537C培养，两管同时变黄为葡萄糖发酵，只有不加矿物油的培养管

19、变黄时为葡萄氧化。二、耐热溶血毒检验方法氯0化钾.7g氯5化镁g制法：加蒸馏水950mL溶解，调pH为9.1,121C高压灭菌15min,室温冷却，加亚硫化钠5g10根据试验证明，神奈川现象阳性菌株， 多数对人的致病性有密切关系，神奈川现象的阳 性物质称“耐热性溶血素”，检验副溶血性弧菌是否产生耐热性溶血毒，可参考下述方法：（一）Sahuria（樱井氏）法 用副溶血性弧菌肉汤培养物上清液为抗原， 与制备的精制耐热性溶血毒的抗血清进行琼脂扩散试验，观察沉淀线。（二）Elek法（本田改良法）以微研No.1琼脂 （Difco胨30g， 磷酸氢二钠30g， 氯化钠40g， 葡萄糖5g,琼脂15g, 蒸

20、馏水lOOOmL,pH7.3）培养37C过夜，在平板上菌落旁约为5mn处放一小滤纸片（上吸有抗血清），室温放一夜，观察滤纸旁有无沉淀红。（三）液体培养检验法（饭田民）用2氯化钠肉汤， 加入少量新鲜红血球， 倾斜培养， 神奈川现象阳性菌株能引起溶血， 而阴性菌株不溶血。（四）反相被动血球凝集法（太田氏）用吸附抗体的红血球测定抗原 （溶血毒） ，此方法极为敏感， 可查出微量耐热性溶血毒。 并发现神奈川现象阴性的菌株也产生少量的耐热性溶血毒。三、至病性试验方法（一）兔肠袢结扎试验选用正常健康家兔，首选使家兔断食24h，用乙醚麻醉，将腹壁切口，露出小肠，选取肠段约5cm左右， 于两端结扎， 注入检菌的肉汤培养物， 同时另选两段作阳性和阴性对照，然后迅速缝合，24h后由耳静脉注入空气杀死，开腹检查，有致病性者注菌肠段可见肿胀积 液，出现坏死现象。一般认为神奈川现象阳性菌株， 兔肠袢结扎试验多数为阳性反应， 神奈川现象阴性菌株 多数为阴性，但亦有少数为阳性者。（二）新生兔经口试验选用12日龄的新