新型聚合物单分散温敏色谱固定相的制备及其在生物大分子分离中的应用

1、新型聚合物单分散温敏色谱固定相的制备及其在生物大分子分离中的应用         11-04-22 11:46:00     编辑：studa20                   作者：欧阳康龙 孙彦璞 龚波林【摘要】  以2.5 m的单分散聚苯乙烯为种子，乙二醇二甲基丙烯酸酯 (ED

2、MA)为交联剂，甲苯和环己醇为致孔剂，采用“一步种子溶胀聚合法”制备了单分散微球; 再以过硫酸钾为引发剂将水溶性温敏单体N异丙基丙烯酰胺(NIPAM)分子引发聚合到微球表面，制备了粒径为7.0 m、分散系数为0.02的单分散交联温敏色谱填料，温敏单体NIPAM的接枝率为5.2%。考察了该填料对标准蛋白质的分离性能、温敏性能、稳定性和重现性以及动态吸附容量对蛋白保留的影响。实验结果表明，该色谱填料对蛋白的分离性能、温敏性能、稳定性及重现性良好，且对溶菌酶的动态吸附容量为32.3 mg/g。在疏水模式下，该填料不但可以同时基线分离5种标准蛋白，而且通过改变温度可以有效地将3种在低温下保留时间重叠的

3、蛋白(细胞色素C、乳球蛋白和核糖核酸酶)完全分离。 【关键词】  N异丙基丙烯酰胺; 单分散温敏色谱固定相; 蛋白质分离Abstract By using 2.5 m monodisperse polystyrene as seeds, ethylene glycol dimethyl acrylate(EDMA) as crosslinking agent, toluene and cyclohexanol as porogen, onestep of seed swelling polymerization method was applied for the preparati

4、on of monodisperse beads. Then the monomer of Nisopropylacrylamide(NTPAM) was polymerized on the surface of monodisperse beads by watersoluble initiator(potassium persulfate) to prepare a 7.0m monodisperse thermosensitive chromatographic stationary phase. Its dispersion coefficient is 0.02 and the g

5、rafting yield of NIPAM is 5.2%. The stationary phase was evaluated in detail to by determining its separability, thermosensitivity, stability, reproducibility and the effect of the dynamic protein loading capacity on the retention of proteins. The results show that the packing has good separability,

6、 thermosensitivity, stability, reproducibility and the dynamic protein loading capacity for lysyme is 32.3mg/g. In the hydrophobic interaction chromatographic model, five standard proteins can be separated by the stationary phase, and cytochome C, lactoglobulin, ribonmclease A can be effectively sep

7、arated by changing the temperature.Keywords NIsopropylacrylamide; Monodisperse thermosensitive chromatographic stationary phase; Separation of proteins1 引 言N异丙基丙烯酰胺(NIPAM)，由于其大分子链上同时具有亲水性的酰氨基和疏水性的异丙基，使得聚NIPAM的水溶液在32 附近具有最低临界溶液温度(LCST)1 。 当温度低于LCST时，表现为以酰胺基为主的亲水模式;当温度高于LCST时，表现为以异丙基为主的疏水模式。通过调节温度可以实现

8、对目标物有效分离和提纯的目的。NIPAM及其共聚物表现出相转变，产生热敏性质。利用其热敏性质，可以制备多种智能高分子材料。这些高分子材料在生物医学2、免疫分析3、催化4及分离提纯5等领域都有广泛的应用。近年来，温敏材料在色谱研究中的应用日趋广泛。为了研究和应用NIPAM的温敏性质，文献6合成了纳米SiO2/PNIPAM水凝胶;文献7制备了温敏性互穿网络(Interpenetrating polymer networks，IPN)的PNIPAAm凝胶;文献8采用聚甲基丙烯酸2羟乙基酯(PHEMA)接枝改性PNIPAAm，提高了PNIPAAm网状结构的亲水性，增强了其柔韧性和生物相容性。目前, 温

9、敏性高聚物在超细硅胶表面接枝的方法有共聚法9、偶联法10和传统自由基引发法11。原子转移自由基聚合(ATRP)技术自问世以来，用于无机材料表面的热敏性聚合物的接枝改性已有报道12,13。本研究以2.5 m的单分散聚苯乙烯为种子，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂，甲苯和环己醇为致孔剂，采用“一步种子溶胀聚合法”制备单分散微球，再以过硫酸钾为引发剂将水溶性单体NIPAM分子引发聚合到微球表面，制备了粒径为7.0 m的单分散交联聚合物温敏色谱固定相。考察了该填料对标准蛋白的分离性能、温敏性能和动态吸附容量等性能。结果表明，该填料合成方法简单，具有分离性能、温敏性能良好和吸附容量大等优点。2

10、实验部分2.1 仪器与试剂LC20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司); CGY100型高压气动泵(北京福思源机械加工部); 2003型电动搅拌器; JY92超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司); KQ250B超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司); N异丙基丙烯酰胺(NIPAM，上海物竞化工科技有限公司);乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，美国Aldrich公司);苯乙烯(St，化学纯，上海试剂一厂);过氧化苯甲酰(BPO，化学纯，上海润捷化学试剂有限公司);十二烷基磺酸钠(SDS，化学纯，汕头光华化工厂);聚乙烯醇(PVA，化学纯，醇解度为88%，天津大学化工实验厂);肌红蛋白(M

11、yo，马心)、核糖核酸酶原(RNaseA，牛红细胞)、糜蛋白酶原A(ChyA，牛胰脏)、细胞色素C(CytC，马心)、溶菌酶(Lys)、乳球蛋白(Lact，牛奶)均购自美国Sigma公司，其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。2.2 固定相的合成与表征将适量粒径为2.5 m的聚苯乙烯种子置于三颈瓶中，加入适量0.2% SDS溶液，在室温下搅拌。将适量的BPO和EDMA置于干燥的烧杯中，超声使BPO完全溶解，然后加入适量的甲苯、环己醇、PVA和SDS溶液，超声乳化至无油滴后，迅速加入到聚苯乙烯种子溶液中，室温下搅拌溶胀24 h。通氮气30 min，升温至70 ，聚合一定时间后，在氮气保护下迅速加入适量的过硫酸钾和NIPAM，继续反应20 h。反应结束后，离心、洗涤、索氏提取器抽提48 h， 50 真空干燥3 h，即可获得单分散聚合物温敏色谱固定相14,15。合成的温敏固定相颗粒大小与表观形态用扫描电子显微镜观测;由元素分析得出单体的接枝率。2.3 固定相动态吸附容量的前沿色谱法测定使用5 cm×0.46 cm 温敏柱，在流动相为50 mmol/L PBS+1.5 mol/L(NH4)2SO4+1.0 mg/mL Lys，流速为1.0 mL/min的条件下，采用前沿突破曲线法测定该固定相的动态吸附容量。2.4 色谱柱的装填及色谱条件以蒸馏水为匀浆液和顶替