疟原虫血片制作

1、疟原虫血片的制作一、需要材料1. 采血器材： 75% 酒精棉球、一次性采血针、玻片、推片、铅笔、干净的绸布或化纤布。2. 染色材料： 姬氏原液 .蒸馏水或纯净水:稀释姬氏原液 染色时冲洗染液固定剂： 用甲醇或无水乙醇（乙醇含量达 99.9% ），固定薄血膜用无水乙醇擦洗油镜头。 脱油剂： 无水乙醚或二甲苯：镜检后的血片脱镜油。油镜头脱油可用无水乙醚：无水乙醇的 7:3 混合液擦拭。 擦镜纸。二、采血前准备：1. 玻片准备我们现在用的玻片都是除去油渍的脱脂玻片， 使用前可用绸布擦去玻片上纤维和浮灰，即可使用。新的尚未脱油脂的玻片：用洗衣粉水洗净后，一一浸泡于 95% 的酒精中约一周时间，然后一一

2、取出，用软而洁净并没有棉花纤维的细布擦干，擦亮，收藏好。已用过的旧玻片：先消毒后用洗涤剂清洗，去除污渍，再一一浸泡于95% 的酒精中约一周时间，然后一一取出， 用软而洁净并没有棉花纤维的细布擦干，擦亮，收藏好。2. 玻片编号：在玻片的磨砂端用铅笔进行编号。玻片编号、检验报告单号和登记号应一致，并具有唯一性。3. 采血时间：间日疟、三日疟原虫患者可在发作的任何时间进行采血，但由于患者刚发冷发热以后，大部分是在环状体期，故这一时期区别疟原虫种类是不容易的。所以在发作后的6 8 小时内采血为最佳，这时环状体以滋养发育成晚期滋养体，较易识别。恶性疟原虫 ;从理论上讲， 因为恶性疟原虫的裂体生殖是在内脏

3、的毛细血管内进行的，所以在发作之前，患者的末梢血液中不易查到，但实际情况不尽如此，一般在受感染者的末梢血液中，随时能见到少量的恶性疟原虫的环状滋养体；虽然如此，较理想的采血时间，是在发作后的 20 小时左右，因为这个时候，环状体虽已发育至最高峰，但尚未回到内脏毛细血管中去进行裂体生殖。环状体的数量和构造。有助于疟原虫种类的鉴别，恶性疟原虫的配子体很容易识别，但在初发时，一般需要在发作 7 10 日后才能在末梢血液在出现，应当注意。4. 采血的部位和方法；部位：以耳垂采血为主。若由指头取血则受检者痛楚较大，且容易引起创口感染，一般不易采用。婴儿可采集足跟或拇指。方法：让受检者位于我们右前方，采集

4、右耳垂血液，这样便于方便操作，以75% 酒精棉球消毒耳垂， （在消毒前挤出多余酒精）待酒精干后，左手拇指和食指紧捏耳垂，右手持一次性采血针迅速刺入，稍用力挤压（酒精不干不能挤压，以免血液流出不成滴状，也不可用干棉花拭去多余酒精，因干棉花中碎纤维较多而污染血膜），采血后应尽快制作血片，时间过长会形成纤维蛋白，出现凝血。5. 厚、薄血膜制作，染色：厚、薄血膜的形态和位置：薄血膜：宽 2 ，长 2.5 .厚血膜直径0.8 1.0 .假定将玻片划成三等分，则厚血膜应位于中格靠右侧线处，薄血膜则从玻片中央起至左格中部止，右端空格供记录姓名，编号或贴标签用。厚血膜制作： 待血液滴呈绿豆大小时，血量大约4

5、5ul 用推片的左端下角刮取血滴，放于载玻片的右侧，自内向外涂成0.8 1.0cm 直径的血膜，涂片结束前回转一下， 使厚血膜均匀。厚血膜制作完毕，用酒精棉球擦去玻片上的血迹，再用干的干净的布拭去残留的酒精，厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到 510 个白细胞为宜。薄血膜的制备：用推片中央沾取一小滴血 , 在玻片左侧距离厚血膜约 0.5cm 处，与载玻片接触， 推片与玻片约成 25 °35 °夹角，当血液沿推片的边缘扩展至2 宽 时向左边匀速推成舌状薄血膜。推成的血膜约成 2cm 宽×2.5cm 长的薄血膜，薄血膜的用血量较少， 约是厚血膜的 1/10 约为 1.

6、0ul 1.5 ul（有推荐用 0.5ul 1.0 ul ）即可。推片速度的快慢和角度均影响薄血膜的厚薄程度，最理想的薄血膜是一层血细胞，血细胞的分布排列比较均匀，无裂缝、无空泡。采血完毕，用干棉花擦拭耳垂上的血液，推片上的血迹用酒精棉球擦去，再用干布擦干待用（不能使用掉纤维的布）。无论在擦拭玻片，制作血片或染色血片时，手指切勿触及玻片之上下面以免手上油脂污及玻片面，使薄血膜涂布不均厚血膜易于脱落。另外推片手持端应作标记，两端尽量不要混拿，以免人手经常拿捏，推片受到手上的油渍污染而影响血膜质量。血片干燥制成的血膜必须完全干燥后方可进行固定染色，否则薄血膜中红细胞边缘褶皱，厚血膜染色时易脱落，而

7、出现网状的背景。反之，血片放置过久则有霉菌及枯草杆菌生长，血红蛋白凝固，也不能镜检。薄血膜在自然情况下约需10 分钟，厚血膜需 30 分钟。应将血片用有盖器皿罩住，防灰尘落入，放37 温箱， 20 分钟可干透。 放入温箱干燥时间不能超过1 周，否则染色后厚血膜背景颜色较深，影响观察。厚血膜如不能及时染色时，先将薄血膜固定，夏天应在48 小时内，冬天应在 72 小时内对厚血膜进行溶血处理（不适用抗凝血） ，干燥后再保存。否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。注意：制成的血片切勿用火烤、日晒或放在新购置的标本盒内，以免血红蛋白凝固无法脱掉。血片放置待干时不可倾斜，否则厚血膜中血细胞沉在一边，可

8、使厚薄不均。此外，还要防止苍蝇吮吸和 灰尘污染。 .固定、染色（姬氏染色法）干燥后的血片用棉签蘸取甲醇或无水乙醇在薄血膜上轻轻涂抹（最好是将甲醇倒入一个干净的50mL 小烧杯中，将薄血膜浸没其中，以减少棉签中的灰尘和碎纤维的污染） ，注意不要碰到厚血膜，否则使血红蛋白凝固，厚血膜不能镜检，约 1 2 分钟血片干后，即可进行染色。染液的稀释：染液在临用前要进行稀释，上面发放的姬氏为原液。其稀释方法： 8m水 ( 到空染色瓶的颈部)加 10 滴原液，染20 25min，实际工作中我们经过比对，觉得8mL水加14 滴原液能达到较为满意的效果，并根据血片的数量，按每张血片滴加染液1.5 2mL 的量，

9、配制稀释液量，稀释后的染色液最好一次用完，放置过久影响着色效果。若厚血膜过厚，可先滴加蒸馏水数滴溶去血红蛋白，约需2min ，时间不宜过长，否则血膜易脱落，倾去蒸馏水，待血膜干后再滴加染液染色，或直接在厚血膜上滴加2 滴蒸馏水后， 不倒去蒸馏水即刻直接滴加稀释染液（注：这两种方法对抗凝血不适用）使染液覆盖整个血膜。 夏天染 25 30min 即可，冬天需 40 60min 能达到较为满意的效果。冲洗、干燥： 血片染到时间后，用蒸馏水冲洗，冲洗时不能对准血膜冲，应在无血膜地方注加蒸馏水，使染液溢出，直到染液冲洗完，切不可先倒去染液，否则染液残渣吸附在血膜上即便再冲洗多遍也无济于事，或在一个盆中放

10、入足够多水，将血片和染液一同浸入水中漂洗并在水中摆动几下 (对于用抗凝血制成的血片，在冲洗时厚血膜极易脱落，所以只能用此种方法漂洗 )，对去除灰尘和染液残渣效果比较好。 冲洗好的血片放于自然环境下 1 2h ，或 37 温箱 20min 左右即可镜检。染色效果判断：着色较好的血膜，红细胞呈淡红色，嗜酸性粒细胞的颗粒呈桔红色，嗜中性粒细胞核呈紫蓝色，中性粒细胞胞浆颗粒呈淡红色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈蓝色或淡蓝色，疟原虫核呈红色。除环状体外，其他各期均可查见疟色素。影响染色效果的因素：染料和溶剂的质量：染料、甲醇和甘油如不纯， 常使配成的染液偏酸或偏碱， 影响染色结果。因此，必须用分析纯的甲醇和中

11、性甘油，配制时所用器具必须干净无水。染液的新旧：新配制的染液，一般着色力较弱，常呈碱性。染液放置时间稍长，染色力逐渐增加，故应在染色前 1 2 周先将染液配好。盛染液的瓶子应密封，以免影响染液质量染液稀释后的使用时间：染液稀释后，一般在半小时内使用，时间太长也会影响染色效果染液的浓度：染液浓度高，着色快，各种细胞着色深，薛氏点、茂氏点等粗大显著；染液浓度低，着色慢，但各种细胞内部结构着色均匀、清晰，如环状体、子孢子及疟色素等颜色分明，但薛氏点、茂氏点不够清楚。染色时间（应根据染液的质量、新旧、浓度和气温决定）；染色时间长，染色效果好，温度高着色快，染色用水的 PH 值（ 7.0 7.2 ）：当

12、染色太蓝，可用 PH 较低的缓冲水冲洗；如染色太红，则用 PH 较高的缓冲水冲洗；如染色太深，可延长冲洗时间，予以纠正。冲洗方法：染色后不能直接将染液倒掉。应将玻片连同染液一起放入水中漂洗，或沿玻片及染色缸边缘加水使染液表层溢出，并轻轻冲洗，以免染色颗粒沾污血膜。附：瑞氏染色与姬氏染色的区别瑞氏染色姬氏染色厚 血 片薄 血 片厚 血 片薄 血 片血片制作相 同相 同相 同相 同干 燥2030 分钟2030 分钟2030 分钟2030 分钟厚、薄血膜染用蒸馏水溶 不需要处理不需要处理用甲醇或无水色前的处理去血红蛋白（若厚血膜较乙醇固定至血膜呈灰厚，可先溶血）白色，干燥染 色 液不需要稀释临用前用

13、蒸馏水稀释染色时间原液染色 1分钟。再加蒸馏气温 20以上染 3040 分钟；水稀释后染 78 分钟。20以下染 4060 分钟。干 燥2030 分钟2030 分钟镜 检100×（油镜头）姬氏染色效果稳定，染色时间和染液浓度对结果影响较小，染色后的血膜保存时间较长，同时姬氏染剂能长期保存而不变质，染色技术也易掌握，被推荐使用， 瑞氏染色法因操作简便，常用于个别血片染色。三、镜检工作中所注意的事项1. 在镜检中显微镜的使用：油镜、凹镜、视野需按一定的顺序逐个检查。2.疟原虫镜检工作中，凡是发热病人。疟疾、疑似疟疾、及不明原因的发热病人均需要进行疟原虫镜检。3. 做好镜检登记： 凡是镜检疟原虫的均需如实登记， 阴阳性片保存待查，4.如发现恶性疟以最快的通信方式上报。四、实际工作中我们发现的几个常见问题归纳如下1. 血片制作不规范比较常 厚血膜血量较大，薄血膜用力不均匀，薄血膜制作较厚 血膜位置不规范，厚、薄血膜安排不当。厚、薄血膜间距离相隔过大血膜太靠近玻片的边缘。厚、薄血膜位置颠倒，方向错误，将薄血膜沿着厚血膜方向推，厚、薄血膜易相触2. 将姬氏染色方法与瑞氏染色方法混淆姬氏原液不稀释，直接滴加在血膜上，使厚、薄血膜均被固定。厚血膜一团黑，不能镜检。薄血膜未固定，直接用姬氏染色，薄血膜脱落。3. 染色时间不够，滴加染液后很快