复方首乌藤合剂微生物限度检查的验证

1、复方首乌藤合剂微生物限度检查的验证论文作者：张婷 郑绍忠 刘全芳2012-1-18 10:58:33摘要 目的：确定可行的复方首乌藤合剂微生物限度检查法。方法：根据中国药典2010年版二部附录 J微生物限度检查法常规法进行验证试验。结果：试验组的菌回收率均大于70%，控制菌常规法验证检出阳性菌，阴性菌未检出。结论：复方首乌藤合剂无抑菌作用，可用常规法进行微生物限度检查。关键词 复方首乌藤合剂；微生物限度检查；验证中图分类号 R927.33 文献标识码 A 文章编号 1673-7210（2011）11（a）-076-03Validation of microbial limit test met

2、hod of Compound Caulis Polygoni Multiflori MixtureZHANG Ting, ZHENG Shaozhong, LIU QuanfangDepartment of Pharmacy, the 175th Hospital of PLA (the Southeast Hospital Affiliated to Xiamen University), Fujian Province， Zhangzhou 363000, ChinaAbstract Objective: To establish a method for the microbial l

3、imit test of Compound Caulis Polygoni Multiflori Mixture. Methods: A validation of microbial limit test method was conducted in accordance with routine method in the appendix of Chinese Pharmacopoeia (2010 edition two parts ). Results: The recoveries of test organisms by routine method were more tha

4、n 70%, the test organisms were detected in the control bacteria test and were not detected in the negative control bacteria test. Conclusion: The Compound Caulis Polygoni Multiflori Mixture has no inhibitory effect, and conventional method can be used in microbial limit test.Key words Compound Cauli

5、s Polygoni Multiflori Mixture; Microbial limit test; Validation微生物限度检查是药品安全性检查的重要项目，目前在国外也越来越受到重视，每版药典收载的品种也越来越多。复方首乌藤合剂是我院自制的中成药口服液，有滋阴清肝、清心安神作用，主要用于神经衰弱性失眠、眩晕及脑外伤性头痛、头昏等。中国药典2010年版规定建立微生物限度检查法时，应对该方法进行验证，以确定该方法的可行性。笔者依据中国药典2010年版二部附录1对该品种进行了菌落计数和控制菌检查方法的验证2。1 仪器与试药1.1 仪器DG-2B多功能恒温箱（上海医疗器械厂）；HWS-40

6、0型恒温恒湿箱（上海精宏实验设备有限公司）；LDZX-40SCI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；101-2A型数显式电热恒温干燥箱（上海阳光实验仪器有限公司）。1.2 药品复方首乌藤合剂（解放军第一七五医院制剂室，40 ml/瓶，批号：100609、100623、100721）。1.3 试验用菌株大肠埃希菌（escherichia coli）CMCC（B）44102、金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）CMCC（B）26003、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）CMCC（B）63501、黑曲霉（aspergillus niger）CM

7、CC（F）98003和白色念珠菌（candida albicans）CMCC（F）98001，以上菌种均购于厦门市药品检验所，金黄色葡萄球菌为第三代，大肠埃希菌为第二代，其余菌均为第四代。1.4 培养基营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、MUG培养基，以上培养基均购于广东环凯微生物科技有限公司。1.5 稀释液pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，购于广东环凯微生物科技有限公司。2 方法与结果2.1 菌落计数方法的验证32.1.1 供试液的制备用pH 7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将复方首乌藤合剂稀释成为110的供试液，充分混匀备用。2.1.2

8、菌液制备2.1.2.1 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物用接种棒接种至营养肉汤培养基中，于（351）培养1824 h。2.1.2.2 取白色念珠菌的新鲜培养物用接种棒接种至改良马丁琼脂培养基中，于（251）培养2448 h；上述培养物均用灭菌生理盐水制成每毫升含菌数小于100 cfu的菌悬液，做活菌计数用。2.1.2.3 取黑曲霉新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，于（251）培养57 d，使黑色的霉菌孢子大部分覆盖培养基斜面为宜，加入5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯-80的灭菌生理盐水并轻轻振摇洗脱下霉菌孢子，过滤孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（m

9、l/ml）聚山梨酯-80的灭菌生理盐水制成每毫升含菌数小于100 cfu的菌悬液，做活菌计数用。2.1.3 菌落计数方法的验证操作试验组：分别吸取上述制备好的110供试液1 ml注入平皿中，再分别加入上述制备好的的5种菌的菌悬液各1 ml，每种菌平行制备2份，立即倾注营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基。供试品对照组：分别吸取上述制备好的110供试液1 ml注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，每种培养基平行制备2份，以测定供试品的本底菌数。菌液组：取上述制备好的5种菌的菌悬液1 ml注入平皿内，每种菌平行制备2份，立即倾注营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，测定所加的试验菌数

10、，并计算回收率。回收率公式为回收率（%）（试验组菌落计数-供试品对照组菌落计数）/菌液组菌落计数100%。以上营养琼脂培养基置3035培养48 h，玫瑰红钠琼脂培养基置2328培养72 h，结果见表1。由表1可见，笔者对复方首乌藤合剂采用平皿法，经过3次平行试验，5种菌的回收率均大于70。故本品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定可依据中国药典2010年版直接取样采用常规法。2.2 控制菌检验方法的验证42.2.1 阳性试验组取上述110供试液10 ml加至100 ml胆盐乳糖培养基中，再加入10100 cfu的大肠埃希菌，依相应控制菌检查方法进行检查。2.2.2 阴性菌对照组方法同试验组，阴性对照菌

11、采用金黄色葡萄球菌，依相应控制菌检查方法进行检查。见表2。从表2可以看出，采用常规法检验复方首乌藤合剂的控制菌，阳性试验组呈阳性反应，阴性菌对照组呈阴性反应，故可用该法进行复方首乌藤合剂控制菌的检查。3 讨论验证试验结果表明复方首乌藤合剂无抑菌作用，可依据中国药典2010年版按常规方法进行微生物限度检查。笔者发现，复方首乌藤合剂静置一段时间后会生成沉淀，在试验时，应充分摇匀，使其分散均匀，且本品虽进行了10倍稀释，但颜色依然较深，在光线较暗的环境下进行菌落计数时不容易分辨菌落，因此应在光源充足的环境下进行菌落计数，对疑似菌须进行菌落培养，确定其是否为菌，以免发生漏数、少数现象，造成试验结果不准

12、确。菌落数的控制在小于100 cfu/ml是试验过程的一大难点，是一项较耗时的操作过程，通常需要多次实践才能够得到符合要求的菌落数。菌落的生长繁殖能力极其旺盛，呈指数级别递增，因此，在用接种棒接种至相应培养基进行增菌，并进行稀释这个过程的重现性很差，很难在同一个稀释级得到相同数目的菌落数，笔者通过多次试验，并查阅相关资料，发现可将细菌稀释至10-6（真菌稀释至10-5），并在其附近选取稀释至10-510-7（真菌选取10-410-6）的菌悬液，每个稀释级取1.0 ml与0.5 ml同步试验，可大大提高菌落数在100 cfu/ml的范围，减少一些繁琐且不必要的操作。参考文献1 国家药典委员会.中国药典S.二部.北京:中国医药科技出版社,2010:附录93.2 吕毅.麻杏止咳糖浆的微生物限度检查J.华西药学杂志，2009,24(1):102-103.3 杨静,陈伟,马宁,等.抗脑衰胶囊微生物限度检查方法学验证J.医学理论与实