乙型肝炎病毒表面抗原M蛋白真核表达细胞株的建立

1、236乙型肝炎病毒表面抗原M 蛋白真核表达细胞株的建立及其表达产物的检测何芳秦山赵连三刘丽(华西医科大学附一院肝炎研究室, 成都610041中国图书分类号R 37312文献标识码A 文章编号10002484X (2001 0520236204摘要目的:建立乙型肝炎病毒表面抗原M 蛋白的单克隆真核表达细胞株。方法:利用磷酸钙法将前期所构建的质粒pRc/C M V 2S 2S 导入小鼠骨髓瘤细胞SP2/0, 用G 418抗性筛选以获得单克隆细胞株, 用点免疫、E LIS A 、Western 印迹法分别检测目的蛋白的表达情况。结果:获得4株具有G 418抗性的单克隆细胞株SP2/02S 2S ,

2、且在转染细胞株中检出了乙肝病毒表面抗原, 优化了该过程中的实验条件。结论:建立了乙型肝炎病毒表面抗原M 蛋白的单克隆真核表达细胞株。关键词乙肝病毒M 蛋白单克隆细胞Construction of monoclone cell lines of SP2/02S 2S and detection of their expressionHE Fang , QIN Shan , ZH AO Lian 2San et al. Viral Hepatitis Research Unit , 1st Univer sity Hospital , West China Univer sity o f Medi

3、cal Sciences , Chengdu 610041Abstract Objective :T o construct a m onoclone cell line expressing M 2H BsAg. Methods :T rans fected SP2/0with pRc/C M V 2S 2S by Cal 2cium Phosphate Method ,selected the cells by G 418,detected H BsAg by D ot 2blot 、E LIS A and Western 2blot hybridization. R esults :By

4、 selection of G 418,G 418resistent cells were obtained ;tests of Western 2blot hybridization and E LIS A dem onstrated their expression of aimed protein. Con 2clusion :M onoclone Cell Lines of SP2/02S 2S were obtained.K ey w ords Hepatitis B virus M 2H BsAg M onoclone cell乙型肝炎对我国人民健康危害极为严重, 目前尚无满意的抗

5、病毒治疗手段1。对乙型肝炎发病机理及抗病毒治疗的基础研究十分重要, 而这些研究常需要乙型肝炎病毒抗原的真核表达系统作为其必要的手段。我们曾经建立了乙肝病毒表面抗原S 蛋白的真核表达细胞株2, 由于M 蛋白(S 蛋白+前S 2蛋白 中含有在乙型肝炎发病机理中具有重要作用的前S 2蛋白, 本研究建立了乙型肝炎病毒表面抗原M 蛋白真核表达细胞株用于乙肝防治的基础研究。11111质粒pRc/C M V 2S 2S 由本室构建, 系将乙肝病毒(H BV 的前S 22S 基因片段插入真核细胞表达质粒Rc/C M V (购自美国Invitrogen 公司 的C M V 立即早期启动子下游后所构建的哺乳动物表

6、达质粒, 该质粒带有Neo 基因。11112SP2/0细胞BA LB/c 近交系小鼠的骨髓瘤细胞株, 由本室提供。11113细胞培养及转染所需试剂RPMI1640(美国GI BC O 公司 、HEPES (德国R oche 公司 、G 418(美国GI BC O 公司 、新生小牛血清(成都华西生化厂 、g 、DNA/CaCl 2/BES 细胞转染液(含pRc/C M V 2S 2S200125m ol/L CaCl 2500l 、pH6196的2×BES 500l , 在转染之前半小时新鲜配制 、P BS 等。11114培养细胞裂解液含各1/200体积015m ol/L DTT/21

7、5mm ol/L E DT A 、5mg/ml Apotinine ,5mg/ml Leupetine 和0. 2m ol/L PMSF 的LAC 缓冲液(20mm ol/L HEPES pH719, 400mm ol/L NaCl , 1mm ol/L E DT A ,9mm ol/L CH APS ,25%甘油 。11115H BsAg 2E LIS A 试剂盒购自华美生物工程公细胞株选用BA LB/c 小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0, 经过G 418抗性筛选, 获得了表面抗原M 蛋白真核表达单克隆细胞株, 本文对其所表达的目的蛋白质进行了检测, 对所涉及的技术条件进行了讨论。1材料与方法11

8、1材料本课题受国家自然科学基金(项目号39670670 、四川省科委九五攻关重大项目及省计委科研基金资助作者简介:何芳, 女,29岁, 传染病学博士;秦山, 博士,31岁, 讲师, 主要从事病毒性肝炎核酸疫苗研究;赵连三, 男,56岁, 博士生导师, 研究员, 主要从事病毒性肝炎分子生物学研究。司, 批号:990601。11116Western 印迹所需试剂丙烯酰胺、甲撑双237丙烯酰胺、过硫酸铵、TE ME D (Fluka 鼠抗H Bs (单克隆抗体,BioG enex 、Multi 2Linker (生物素标记的广谱二抗,BioG enex 、Label 2AP (亲和素标记的碱性磷酸酶

9、,BioG enex 、Label 2HRP (亲和素标记的辣根过氧化物酶,BioG enex 、脱脂奶粉。11117化学发光系统发光剂为鲁米诺(Luminol , Fluka 、增强剂为对碘苯酚(Paraidophenol ,Fluka 、氧化剂为双氧水。11118其他材料超声粉碎仪(S onics&Materials 、PVDF 膜(Millipore ,X 光胶片、酶标仪(Bio 2Rad ,M od 2el450 等。112方法11211pRc/C M V 2S 2S 对SP2/0细胞的磷酸钙法转染将对数生长期的5×105SP2/0细胞传代至10cm 培养皿, 继续培

10、养24h 后加入DNA/CaCl 2/BES 转染液混匀, 在35、3%CO 2的条件下继续培养7h 后换液。11212单克隆细胞株的建立质粒转染2d 后, 培养液中加入G 418至终浓度为200g/ml (预实验的结果显示, 该浓度为2w 内使SP2/0细胞全部致死的最低浓度 , 使细胞在G 418抗性选择下生长, 每35d 换液1次,2w 后在显微镜下挑选生长较好的单克隆细胞, 将细胞传入96孔组织细胞培养板中生长,1014d 后传入24孔组织细胞培养板中生长, 1014d 后传入细胞培养瓶中生长,35d 后每株细胞分传为数瓶分别用于冻存及检测。此过程中同时用含G 418(200g/ml

11、的选择培养液培养SP2/0细胞作对照, 以确保该选择培养液的可靠性及SP2/0细胞未被污染。11213转染细胞培养上清中H BsAg 的检测取上述制备的单克隆细胞株, 传代培养3d 后收集上清, 离心后取上清用E LIS A 法检测H BsAg , 操作完成后用酶标仪在双波长450nm/655nm 下读取OD 值, 方法参照药盒说明书。11214细胞裂解液的制备选择在抗性下生长较好的细胞株, 随机收集其中的一批细胞于011ml 的细胞裂解液中, 用超声破碎后,10000r/min 离心10min , 收集上清, 相同方法收集未转染pRc/C M V 2S 2S 的SP2/0细胞裂解液上清, 置

12、-20冻存备用3。11215点免疫取上述制备的裂解液上清10l , 100、3min 变性后点样于预先用甲醇处理过的PVDF 膜上, 一式两份备用。11216S DS 2PAGE 电泳取上述制备的裂解液上清10l 与5l 3倍上样缓冲液混匀,100、3min 变性后点样作S DS 2PAGE 电泳, 电泳结束后在15V 、4条件下过夜将凝胶上的蛋白质转移到PVDF 膜上, 一式两份备用。转移完成后以考马斯亮蓝染色凝胶以判断转移效果。11217杂交将点免疫和电泳转移后的PVDF 膜在5%脱脂奶粉中封闭1h , 一式两份的膜中, 一份再用1300Multi 2Linker 封闭1h 后再用1300

13、的La 2bel 2AP 封闭1h , 另一份则不同Multi 2Linker 及Label 2AP 封闭, 此后所有的膜均进行以下的处理:11000的鼠抗2H Bs 室温孵育1h ,T BST 洗涤3次,1300的Multi 2Linker 室温孵育1h ,T BST 洗涤3次,1300的Label 2HRP 室温孵育1h 后备检。11218化学发光法检测目的蛋白按表1的方法配制发光底物液, 将已杂交的PVDF 膜用T BST 缓冲液洗涤3次后, 移入暗室, 红灯下操作。将浸有发光底物液的滤纸铺于PVDF 膜上, 使膜下的X 光胶片感光1015s , 显影5min , 定影5min 后清水清

14、洗, 根据曝光点或条带判读结果4。2结果211单克隆细胞系的建立pRc/C M V 2S 2S 转染SP2/0细胞后, 可见细胞的成簇生长, 经过2个月的G 418抗性筛选, 获得4株在G 418抗性下生长良好且能表达H BsAg 的SP2/02S 2S 细胞株, 而未转染质粒的SP2/0细胞在G 418(200g/ml 抗性下不能生长且不能表达H BsAg 。212H BsAg 的E LIS A 检测结果见表2。213蛋白质的转移在转移完成后, 用考马斯亮蓝染色转移后的凝胶, 可见到淡淡的蛋白质条带, 证明该实验转移效果较好, 大部分蛋白质已转移到了PVDF 膜上。214点免疫本实验将蛋白质

15、样品直接点膜后进行杂交分析。发现没用Multi 2Linker 及Label 2AP 封闭的膜上, 包括未转染的SP2/0细胞裂解液上清在内的所有标本均有阳性信号; 而预先用Multi 2Linker 及Label 2AP 封闭的膜上, 则仅有Dane 颗粒(阳性对照 及转染pRc/C M V 2S 2S 的SP2/0细胞裂解液上清才有阳性信号, 未转染pRc/C M V 2S 2S 的SP2/0细胞裂解液上清则无阳性信号(图1 。215W estern 2Blot 印迹杂交检测的结果显示, 没用Multi 2Linker 及Label 2AP 封闭的膜上, 所有标本均有信号条带, 而用Mul

16、ti 2Linker 及Label 2AP 封闭后, 则只有Dane 颗粒及转染pRc/C M V 2S 2S 的SP2/0细胞裂解液出现目的蛋白质条带(图2 , 符合预期的实验结果。238表1发光底物液的配制T ab. 1Prep aration of the substrate for the chemiluminescencedetection1mm ol/L45mm ol/L 40mm ol/L 0. 1m ol/L total Ingredient Luminalparaiodopenol hydrogenT ris. Clv olumeperoxide s olutionV olu

17、me2ml13312l520l1347l4ml表2E LISA 检测细胞上清中HBsAg 的O 1D 1值(450nm/655nmT ab. 2O. D. value of HBsAg in the cell supernatant detectedby E LISASam ple SP2/0cell SP2/02S 2S P ositive cell Blank Negative control control OD value0108601344010000108511 107图1点免疫结果Fig. 1R esult of Dot Immuno 2B lotN ote :1.Dane s

18、particle ;2. Dane s particle ;3. supernate of lysised SP2/02S 2S cell ;4. supernate of SP2/02S 2S cell cultrue ;5. supernate of lysised SP2/0cell ;6. supernate of SP2/02S 2S cell cultrue.图2用Multi 2linker 及Label 2AP 封闭后的Western 2B lot 杂交结果Fig. 2R esult of Western 2B lot hybridizationN ote :Lane1. Dan

19、e particle ;2. supernate of lysised SP2/0cell ;34. super 2nate of lysised SP2/02S 2S cell ;5. Protein marker.3讨论pRc/C M V 2S 2S 是本室所构建的重组真核细胞表达质粒, 自身带有Neo 基因, 能表达G 418抗体, 本研究用该质粒到磷酸钙法转染小鼠骨髓瘤细胞。G ra 2ham 等首先成功地将磷酸钙法应用于哺乳动物细胞的转染5, 随着该技术的广泛应用, 人们发现影响转染成功与否及转染效率高低的因素较多, 一些转染条件可能在某实验室应用很成功, 但在其他实验却有一些变动。

20、本实验发现, 磷酸钙2DNA 混合物在室温下静置30min 即可, 且在将该混合物加入培养细胞后, 继续培养的时间不能超过710h , 否则转染效果较差, 细胞易于死亡, 这可能与培养时间越长, 大颗粒磷酸钙沉淀越易析出有一定关系。在转染成功后, 经抗性筛选获得了4株能高效表达前S 22S 蛋白的单克隆细胞, 为乙肝治疗和预防的基础研究提供了又一种工具。在现代分子生物学技术中, 对目的分子的检测, 常用的方法有放射性同位素自显影法、化学发光法以及显色法, 显色法又包括地高辛显色系统、NBT/BCIP 显色系统、DAB 显色系统等。化学发光法由于其发光剂的不同, 则其操作方法亦有别, 且在不同的

21、实验室其条件可能有所差别, 本实验先用鲁米诺发光剂, 且对实验条件进行了优化。鲁米诺化学发光检测系统的原理是:辣根过氧化物酶能在双氧水存在的条件下分解鲁米诺并发出可见光, 该反应能被碘苯酚所催化。本研究将底片曝光1015s , 得到了较好的实验效果4。SP2/0细胞是一株被广泛应用的小鼠骨髓瘤细胞。由于当前利用小鼠制备的单克隆抗体已得到广泛应用, 市售的抗体系多为抗鼠抗体, 而SP2/0细胞作为骨髓瘤细胞自身又具有抗体合成功能, 在这种情况下, 为避免小鼠骨髓瘤细胞所合成抗体造成假阳性结果出现, 作免疫或Western 2Blot 印迹时, 加入I 抗之前必须先用小鼠的抗体封闭骨髓瘤细胞中自身

22、所含有的抗体位点, 再进行常规的蛋白质免疫印迹检测; 同时, 用含G 418的选择培养基同步培养未转染pRc/C M V 2S 2S 的SP2/0细胞, 以确保该选择培养基的可靠性及SP2/0细胞未被污染, 最终得到了预期的实验结果。表明本实验获得了能表达乙肝病毒表面抗原M 蛋白的单克隆细胞株。(下转第243页疗后机体免疫功能恢复的影响J . 中国肿瘤生物治疗杂志,1998;5(1 :392弭静, 曹雪涛, 王全兴et al . 脾内移植G M 2CSF 基因修饰胎肝细2437Adachi Y,Arii S , Funaki N et al . Tum oricidal activity of

23、 K upffer cellsaugmented by anticancer drugs. Life Sci ,1992;51:1778Y ellin M J ,Brett J ,Baum D et al . Functional interactions of T cell withendothelial cells :the role of CD40L 2CD402mediated signals J . J Exp M ed ,1995;182:18579Cells M , Scheideger D , Palmer 2Lehmann K et al . Ligation of CD40

24、ondendritic cells triggers production of high levels of interleukin 212and en 2hances cell stimulatory capacity :T2T help via APC activation.J Exp M ed , 1996;184:74710S tout R D ,Suttles J. The many roles of CD40in cell 2mediated in flamma 2tory responsesJ . Immunol T oday ,1996;17:48711Purlens C ,

25、Verhasselt V , G roote D D et al . Human dendritic cell re 2sponses to lipoplysaccharide and CD40ligation are differentially regulated by interleukin 210J . Eur J Immunol ,1997;27:1848胞对化疗造血损伤的促恢复作用J . 中华血液学杂志,1998;19(12 :6563弭静, 曹雪涛, 袁孟彪et al . 脾内途径G M 2CSF 基因疗法增强巨噬细胞功能的研究J . 免疫学杂志,1998;14(2 :824T

26、en 2Hagem TL M ,Vianen W V V ,Bakker 2W oudenberg I A J M. Is olationand characterization of murine K upffer cells and splenic macrophagesJ . J Immunol M ethods ,1996;193:815K an Z , Ivancev K,Lunderquist A et al . In viv o microscopy of hepaticmetastases :dynamicobservation of tum or cell invasion

27、and interaction with K upffer cellsJ . Hepatology ,1995;21:4876Bouwens L ,M arinelli A , K uppen P J K et al . E lectron microscopic obser 2vations on the accumulation of large granular lym phocytes (Pit cells and K upffer cells in the liver of rats treated with continuous in fusion of in 2tereukin 22J . Hepatology ,1990;12:1365收稿2000205214修回2000208207(编辑张慧(上接第238页M olecular BiologyM. 3rd ed.John W iley&S ons Inc ,1995:10112101864穆仁懋, 唐红, 刘丽et al. 高灵敏化学发光自显影用于斑点杂交检测血清H BVDNAJ . 中华微生物学和免疫学杂志,1997;17(2 :1525G raham F L ,Van der Eb A J. A new t