开题报告2稿汇总

1、陇东学院生命科学与技术学院本科学士学位论文开题报告 题目：大肠杆菌噬菌体分离纯化研究学 院：生命科学与技术学院专 业： 生物科学 班 级： 10级生科（1）班姓 名： 郑小云 指 导 教师： 毛宁 2013 年 5 月 12日大肠杆菌噬菌体分离纯化研究一、选题的目的和意义1、选题目的噬菌体是一类感染细菌、放线菌等微生物的病毒，体积微小、结构简单、具有严格的寄生性，广泛存在于自然界的各个角落，包括河水、土壤、污水以及健康人的机体中。噬菌体作为指示微生物，在监测水质环境、指示污染程度等方面的研究有非常重要的作用。因此，分离和研究噬菌体，弄清噬菌体与其宿主之间的生态学关系，对于监测水质环境，控制水质

2、污染等方面的工作无疑具有重要指导意义。大肠杆菌噬菌体，是指寄生在大肠杆菌内的一种噬菌体，属于细胞病毒的一种，具有专一性,一种噬菌体只在一种细菌中生活,而不能在另一种细菌中生活。它主要存在于一些动物的粪便和污染水源中，肠出血性大肠杆菌引起的疾病症状包括腹部绞痛和腹泻，一些病例可能发展为血性腹泻（出血性大肠炎）。潜伏期3至8天，平均为3至4 天。大多数病人10天内康复，但是有少数病人（特别是幼儿和老年人）的染病可能发展为威胁生命的疾病，例如溶血尿毒综合症（HUS）。溶血尿毒综合症的特点是急性肾衰竭、溶血性贫血和血小板减少。据统计63%至 85%的病例是由于通过食物感染病菌的。大肠杆菌噬菌体是一种可

3、以感染大肠杆菌并且在大肠杆菌体内复制繁殖的病毒，当其感染大肠杆菌后，便会破坏大肠杆菌的细胞结构以及引起细菌致死，待大肠杆菌死亡之后，繁殖的大量噬菌体便会冲破死亡大肠杆菌，再去感染别的大肠杆菌，最终引起大肠杆菌的大范围死亡。鉴于噬菌体有溶菌作用和严格的种型特异性，可利用噬菌体作细菌的鉴定和分型，亦可用于检测标本中的未知细菌和防治某些传染病。噬菌体作为一种新的治疗制剂已受到广泛关注1，本试验旨在通过分离大肠杆菌噬菌体, 研究其生理特性，为噬菌体作为一种生物制剂用于治疗细菌性感染提供实验依据，为预防和治疗大肠杆菌感染引起的疾病探索一种有效的方法。2、选题意义本研究旨在探索大肠杆菌噬菌体的基本生理特性

4、，及大肠杆菌噬菌体与大肠杆菌的寄生关系。对于利用大肠杆菌噬菌体治疗大肠杆菌引起的疾病方面的研究提供实验依据，为大肠杆菌感染患者做出一份贡献，有助于其早日康复。通过本试验，让我将所学的生物专业课程应用到实验中去，在实验过程中总结和运用四年所学的知识；同时也通过实验过程复习有关实验的基础知识和基本操作方法，锻炼实验操作能力，为以后工作打下坚实的基础。二、选题的依据大肠杆菌噬菌体是一类寄生于大肠杆菌体内的病毒，其个体形态极其微小，噬菌体具有非常专一的寄生性，它只能在特异的寄主细胞中增殖。另外，噬菌体缺乏独立代谢的酶体系，不能脱离寄主而自行繁殖。因而噬菌体的繁殖必须依赖于寄主细胞的繁殖，它只能在活的、

5、正在繁殖阶段的细胞中繁殖；而在死的、衰老的、处于休眠状态的细胞中，或在代谢产物或培养基上均不能繁殖。为此，必须采用特殊的方法对噬菌体进行分离检查。当烈性噬菌体侵染大肠杆菌后会迅速引起敏感大肠杆菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑噬菌斑。噬菌体的效价即1ml样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且

6、清晰度高，故计数比较准确。 Ca2+和Mg2+能够促进噬菌体的吸附与注入2，有利于噬菌体的繁殖，对促进噬菌体的形成有明显效果，所以在培养基中添加Ca2+和Mg2+时，可以提高噬菌体的出斑率。三、国内外研究概况英国细菌学家和内科医生Frederick Twort和法裔加拿大细菌学家Flix DHerelle分别在1915年和1917年独立发现了噬菌体，不久之后就用来治疗感染性疾病。Dherelle最早从来自痢疾的临床样本研究中观察到噬菌体滴度的增加正好伴随着病人的康复过程。他将噬菌体称为“外源性免疫因子”3 。1934年美国科学家报道了利用噬菌体疗法治疗肠球菌感染的成功率可达80% 4 。但随着

7、抗生素的成功推广应用，二次世界大战之后美国和西欧的大多数国家都终止了噬菌体制剂的研制。近年来细菌耐药性问题不断突现，用抗生素治疗细菌感染面临巨大的挑战，一些科学家和临床工作者开始重视噬菌体制剂的研制。研究者Harper解释了为什么噬菌体疗法现在又被重新使用起来了，因为每一个噬菌体对某种类型的细菌有高度的特异性，而且它们需要正确的宿主细胞才能够进行复制。靶细菌越多，噬菌体的繁殖速度越快，越能在最短时间内杀死细菌。因此用噬菌体来治疗大量细菌的感染性疾病变得有可能，比如慢性耳朵感染、肺部感染以及伤口感染等。研究者还表明，对于多种类型的细菌感染，仅仅需要一点点噬菌体就可以治疗感染性疾病。而且我们可以直

8、接用噬菌体型的喷雾剂、滴液或者膏状物来治疗感染，当然了，最主要的好处是噬菌体不会感染人类的细胞，从这点来说，噬菌体治疗方法对于治疗人类的细菌性感染疾病变得非常安全。近年来，日益增加的细菌抗生素耐药性对于我们治疗感染来说越来越困难，而且新型抗生素研发的速度远远赶不上耐药细菌出现的速度。目前研究者正在加速研究噬菌体治疗细菌感染这种疗法。目前，噬菌体疗法的临床试验正在进行之中，第一例临床安全试验是2005年进行的，相关试验结果于2009年已经发表出来了，结果证实了噬菌体疗法的有效性和安全性。研究由Ampliphi公司进行，一旦临床试验成功后，未来，噬菌体的治疗方法将会彻底治疗细菌感染以及细菌的耐药性

9、。四、研究内容本实验首先活化培养实验室保藏的大肠杆菌E. coli NO1和E. coli NO2至对数期600nm（OD值0.8左右），然后取大肠杆菌培养液6ml于盛有50ml3倍牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，加入污水样100ml（离心并过滤除菌），继续37摇床振荡培养12-14h，以增殖噬菌体。再将以上培养液3000r/min离心30min，将上清液过滤除菌，取100ml滤液及5ml大肠杆菌液加入50ml 3倍牛肉膏蛋白胨培养液中，37培养12-18h进行噬菌体富集。继续将以上富集液3000r/min离心30min后，取上清液10ml加入 5ml 3×倍牛肉膏蛋白胨培养液及相应宿

10、主菌液1ml，室温下放置 1h，37 120rpm振荡培养 3.5h，如此这样反复几次富集噬菌体。最后收集大肠杆菌噬菌体测定它的效价、观察噬菌体对不同宿主菌的裂解曲线和Ca2+、Mg2+对噬菌体裂解率的影响。五、研究方法及步骤1材料噬菌体样品来源：阴沟污水（100ml），土壤菌种：陇东学院生命科学与技术学院微生物实验室保藏的大肠杆菌E. coliNO1和E. coliNO2培养基： 3倍牛肉膏蛋白胨培养液（4瓶，每瓶50ml），牛肉膏培养液，牛肉膏蛋白胨半固体培养基（倒上层用），牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（倒底层平板用）实验器材：离心机，细菌滤器，抽滤装置，恒温水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，

11、无菌涂布器，无菌吸管，培养皿，三角瓶，移液管，试管，漏斗等2方法2.1大肠杆菌噬菌体的分离A.培养大肠杆菌：活化培养实验室保藏的大肠杆菌E. coli NO1和E. coli NO2至对数期600nm（OD值0.8左右）5。B.增殖噬菌体样品：取上述大肠杆菌培养液6ml于盛有50ml 3倍牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，后加入污水样100ml（离心并过滤除菌），继续37摇床振荡培养12-14h，以增殖噬菌体。C.富集噬菌体：将以上培养液3000r/min离心30min，将上清液过滤除菌，取100ml滤液及5ml大肠杆菌液加入50ml 3倍牛肉膏蛋白胨培养液中，37培养12-18h进行噬菌体富集。

12、将以上富集液3000r/min离心30min后，取上清液10ml加入 5ml 3×倍牛肉膏蛋白胨培养液及相应宿主菌液1ml，室温下放置 1h，37 120rpm振荡培养 3.5h。D.收集噬菌体：将上述培养液于 4下 12000g 离心 30min，上清液再经微孔滤膜（0.22m）过滤，滤液即为拟含有相应宿主菌噬菌体的原液。E.验证噬菌体存在：在大肠杆菌平板上，滴加上述滤液5-7小滴,同时滴加生理盐水作为对照，进行标记，37培养18-20h，若出现噬菌斑，则证明滤液中存在噬菌体6,7。 2.2大肠杆菌噬菌体的纯化(1)用接种环取菌液一环接种于液体培养基内，再加人0.1ml大肠杆菌悬液

13、，使混合均匀。(2）取上层琼脂培养基，溶化并冷至48（可预先溶化、冷却，放48水溶箱内备用）,加入以上噬菌体与细菌的混合液0.2ml，立即混匀，并立即倒人底层培养基上，混匀，置37培养12h。(3）此时长出的分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，再用接种针在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有大肠杆菌的液体培养基内。于 37培养。（5）等待管内菌液完全溶解后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体。2.3噬菌体效价的测定（1）倒平板：将融化后冷却到45左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中，每皿约倾注10ml培养基，平放，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。 （2）稀释噬菌体

14、：按10倍稀释法，吸取0.5ml大肠杆菌噬菌体，注入一支装有4.5ml1%蛋白胨水的试管中，即稀释到10-1，依次稀释到10-6 稀释度。 （3）噬菌体与菌液混合:将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1ml于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1ml无菌水，并分别于各管中加入0.2ml大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。 (4)接种上层平板:将11支融化并保温于45的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基5ml分

15、别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速摇匀，立即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。水平静置，凝固后置37培养。 （5）观察并计数：观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于实验报告表格内，选取每皿有30300个噬菌斑的平板计算噬菌体效价8,9。计算公式： N=Y/V×X（：效价值，：平均噬菌斑数皿，：取样量，：稀释度） 例如：当稀释度为10­6 时，取样量为0.1ml/皿，同一稀释度中3个平板上的噬菌斑的平均值为186个，则该样品的效价为：1860.1×10­61.86×109。 2.4噬菌体对大肠杆菌的裂解曲

16、线在细菌悬液中加入噬菌体，由于噬菌体对细菌的裂解作用，导致细菌悬液OD600的值产生变化，由此得到噬菌体对细菌的裂解曲线。分别以E. coli NO1和E. coli NO2作为宿主菌。将过夜培养的细菌悬液以1：100的比例转接到100ml LB培养基中，37160rpm振荡培养1.5h（OD600约0.5，约 1.5×108cfu/ml），将菌悬液平均分装在2个无菌的锥形瓶中，向其中分别加入E. coli NO1和E. coli NO2噬菌体悬液 1×109pfu（经过 0.22m微孔滤膜过滤），立即置于 37160rpm振荡培养，每隔 20min取样100L，测定OD6

17、00的值。同时以不加噬菌体的细菌作为对照。试验重复三次。2.5 Ca2+、Mg2+对噬菌体裂解率的影响在下层固体琼脂和上层半固体琼脂中分别加入Mg2+, 使终浓度分别为0、50、100、150、200、250、 300、350、400、450mg/L, 然后取1.0×103pfu/ ml的噬菌体液和培养8h 的菌液，用双层平板法，测定出斑情况10。六、预期结果通过本实验我们将从污水中分离纯化出大肠杆菌噬菌体，然后进行噬菌体效价的测定，选出效价较高的噬菌体绘制噬菌体对不同宿主菌的裂解曲线，最后向培养基中加入Ca2+和Mg2+ 测定噬菌体的出斑率，可以发现Ca2+和Mg2+对噬菌体的出斑

18、率会有一定的影响。七、论文工作进展安排2013年3月2013年4月 查阅相关文献选题2013年5月2013年6月 写开题报告2013年7月2013年8月 准备相关材料、仪器和试剂2013年9月2013年11月 进行实验2013年12月2014年1月 处理实验数据2014年2月2014年3月 撰写论文2014年4月2014年5月 修改论文并定稿2014年6月 论文答辩、填写毕业论文手册八、参考文献 1 Alisky J,Iczkow ski K, Rapoport A. Bacteriophages s how promis as antimicrobial agent s J . J Infe

19、ct , 1998, 36: 5- 15.2李维泉, 姚鹤鸣, 沈美娟. 病毒学报, 1999, 15( 2) : 172 - 179.3dHerelle,F.1926.The bacteriophage and its behavior,117-121. Williams and Wilkins,Baltimore, Md. 4Payne RJ,Phil D,Jansen VA.Phage therapy:the peculiar kinetics of selfreplicating pharmaceutic- alsJ. Clin Pharmacol Ther, 2000, 68(3):225-230.5 Jamalludeen N, John son RP, Fri ends hip R, et al. Isolation and characterization of n