生物质糖化和乙醇发酵菌种资源的研究

1、生物质糖化和乙醇发酵菌种资源的研究英文题名 Reviewn on Microorganism Resource Releated to Biomass Saccharification and Ethanol Fermentation 关键词 糖化酶; 酵母菌; 淀粉酶; 基因序列; 英文关键词 saccharification enzyme; yeast; Amylase enzyme; sequence of gene; 中文摘要 糖化和发酵菌种的应用是燃料乙醇生产的核心技术环节,菌种资源的优劣直接关系到燃料乙醇的转化效率。本文试验材料为从我国工业微生物菌种保藏中心购买的商业菌株和实验室自

2、筛菌株,首先对收集到的90个优势菌株基本信息进行采集汇总,在此基础上对其进行形态学特征观察和分子鉴定。为了对菌种资源进行有效的保管,分别建立沙土管、冻干管和超低温保藏管三个长期保存体系,并通过入库前后各项指标的测定分析得出不同菌株的最适长期保存体系。主要研究结果如下： 1.共收集到90个菌株,其中乙醇发酵菌株40株,产淀粉酶菌株12株,糖化菌株23株,产果胶酶菌株5株,产纤维素酶菌株10株。 2.分别对霉菌、细菌和酵母菌的菌落特征和个体形态特征进行了观察和描述。 3.通过入库前后菌株形态变化、存活率高低、糖化菌株酶活峰值和发酵菌株酒精度峰值的综合比较,结果表明超低温保藏体系对于产孢子的霉菌保藏

3、效果不理想,部分菌株半年后复溶存活率低于50%,糖化酶酶活、果胶酶酶活以及CMC酶活下降较快；沙土管保藏体系则适宜保藏产孢子的霉菌；冻干管保藏体系试验效果最为理想对被试霉菌、细菌、酵母菌的保藏均比较适宜。 4.通过对10株被试酵母菌. 英文摘要 Saccharification and applications of fermentation microorganism are the Core technology areas of the fuel ethanol production, and the conversions 摘要 4-5 Abstract 5-6 第一章 前言 12-2

4、2 1 菌种资源 14-17 1.1 糖化菌种 14-16 1.1.1 产淀粉酶菌种 14-15 1.1.2 产纤维素酶菌种 15-16 1.2 发酵菌种 16-17 1.2.1 耐高温菌种 16 1.2.2 耐高浓度乙醇的菌种 16-17 1.2.3 戊糖发酵菌种 17 2 菌种保藏体系 17-18 2.1 国内外保藏体系研究进展 17-18 2.2 保存方法的研究 18 3 菌种鉴定 18-19 3.1 常规鉴定 18-19 3.2 分子生物学鉴定 19 4 目前存在的主要问题 19-20 5 本研究的目的、意义和主要研究内容 20-22 5.1 目的与意义 20-21 5.2 主要研究内

5、容 21-22 第二章 菌种的收集与保藏体系的建立 22-30 1 方法 22-25 1.1 菌种来源 22 1.2 主要药品与试剂 22-23 1.3 仪器设备 23 1.4 孢子活化培养基及培养条件 23 1.5 菌种的活化 23-24 1.6 沙土管保藏菌种的制作 24 1.7 冻干保藏菌种的制作 24 1.8 超低温保藏菌种的制作 24-25 2 结果与分析 25-30 2.1 菌种收集 25 2.2 菌种保存方法比较 25-29 2.2.1 三个保藏体系菌株复溶菌落形态比较 25 2.2.2 三个保藏体系保藏半年后菌株存活率比较 25-29 2.3 保藏管制作结果 29-30 第三章

6、 菌株形态特征观察 30-63 1 材料与方法 30-33 1.1 材料 30 1.2 方法 30-33 1.2.1 菌种的活化 30 1.2.2 菌落形态观察 30-33 1.2.3 菌株个体形态观察 33 2 结果与分析 33-63 2.1 霉菌 33-51 2.1.1 黑曲霉Aspergillus niger 33-35 2.1.2 米曲霉Aspergillus oryzae 35-37 2.1.3 黄曲霉Aspergillus flavus 37 2.1.4 泡盛曲霉Aspergillus awamori 37-38 2.1.5 无花果曲霉Aspergillus ficuum 38 2

7、.1.6 宇佐美曲霉Aspergillus usamii 38-39 2.1.7 烟曲霉Aspergillus fumigatus 39-40 2.1.8 柱黄曲霉Aspergillus flavus var. column 40 2.1.9 炭黑曲霉Aspergillus carbonarius 40 2.1.10 黄叉曲霉Aspergillus flavo-furcati 40-41 2.1.11 寄生曲霉Aspergillus parasiticus 41 2.1.12 溜曲霉Aspergillus tamarii 41 2.1.13 康宁木霉Trichoderma koningii 4

8、1-42 2.1.14 木霉属Trichoderma sp 42 2.1.15 绿色木霉Trichoderma viride 42-43 2.1.16 葡枝根霉Rhizopus stolonifer 43 2.1.17 台湾根霉Rhizopus formosensis 43 2.1.18 少根根霉Rhizopus arrhizus 43-51 2.2 酵母菌 51-53 2.2.1 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 51-52 2.2.2 葡萄汁酵母Saccharomyces uvarum 52 2.2.3 热带假丝酵母Candida tropicalis 52-53

9、2.2.4 蜜蜂生球拟酵母Torulopsis apicola 53 2.2.5 威尔酵母Saccharomyces willianus 53 2.2.6 嗜单宁管囊酵母Pachysolen tannophilus 53 2.3 细菌 53-63 2.3.1 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 53-54 2.3.2 地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis 54-55 2.3.3 解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens 55 2.3.4 蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus 55 2.3.5 运动发酵单孢菌Zymomonas mo

10、bilis 55-56 2.3.6 井式假单孢菌Pseudomonas wellantypieum 56-63 第四章 菌株酶活和酒精度的测定 63-78 1 材料与方法 63-70 1.1 材料 63 1.2 仪器设备 63-65 1.3 主要药品与试剂及培养基 65-66 1.3.1 主要药品与试剂 65 1.3.2 培养基配方 65-66 1.4 方法 66-70 1.4.1 产酶特性曲线的测定 66-68 1.4.2 酶活的测定 68-69 1.4.3 还原糖含量的测定(DNS法) 69-70 1.4.4 酒精度的测定 70 2 结果与分析 70-78 2.1 糖化菌株产酶特性及其入库

11、前后的峰值 70-71 2.2 产纤维素酶菌株产酶特性及其入库前后的峰值 71-73 2.3 产果胶酶菌株产酶特性及其入库前后的峰值 73-74 2.4 产耐高温-淀粉酶产酶特性及其入库前后的峰值 74-75 2.5 酵母菌发酵特性及其入库前后的峰值 75-78 第五章 菌种的分子鉴定 78-89 1 材料与方法 78-84 1.1 材料 78-79 1.1.1 选用菌株和载体 78-79 1.1.2 培养基与试剂 79 1.1.3 仪器设备 79 1.2 方法 79-84 1.2.1 增殖培养 79 1.2.2 基因组DNA的提取 79-81 1.2.3 PCR扩增 81-82 1.2.4

12、回收PCR产物 82 1.2.5 连接至T载体 82-83 1.2.6 TOP10感受态细胞的制备 83 1.2.7 热激转化与检测 83-84 1.2.8 序列的测定 84 1.2.9 序列比较及系统发育树的构建 84 2 结果与分析 84-89 2.1 PCR扩增 84-85 2.1.1 细菌16S rDNA的PCR扩增 84 2.1.2 酵母菌26S rDNA的PCR扩增 84-85 2.2 序列比较 85-88 2.2.1 酵母菌26S rDNA序列比较 85-87 2.2.2 细菌16S rDNA序列比较 87-88 2.3 基于26S rDNA序列的系统发育树 88-89 第六章

13、主要结论及几个问题的讨论 89-91 1 重要结论 89 2 创新点 89 3 几个问题的讨论 89-91 参考文献 91-96 致谢 96-97 1.1.3 仪器设备 79 1.2 方法 79-84 1.2.1 增殖培养 79 1.2.2 基因组DNA的提取 79-81 1.2.3 PCR扩增 81-82 1.2.4 回收PCR产物 82 1.2.5 连接至T载体 82-83 1.2.6 TOP10感受态细胞的制备 83 1.2.7 热激转化与检测 83-84 1.2.8 序列的测定 84 1.2.9 序列比较及系统发育树的构建 84 2 结果与分析 84-89 2.1 PCR扩增 84-8

14、5 2.1.1 细菌16S rDNA的PCR扩增 84 2.1.2 酵母菌26S rDNA的PCR扩增 84-85 2.2 序列比较 85-88 2.2.1 酵母菌26S rDNA序列比较 85-87 2.2.2 细菌16S rDNA序列比较 87-88 2.3 基于26S rDNA序列的系统发育树 88-89 第六章 主要结论及几个问题的讨论 89-91 1 重要结论 89 2 创新点 89 3 几个问题的讨论 89-91 参考文献 91-96 致谢 96-97 1.1.3 仪器设备 79 1.2 方法 79-84 1.2.1 增殖培养 79 1.2.2 基因组DNA的提取 79-81 1.

15、2.3 PCR扩增 81-82 1.2.4 回收PCR产物 82 1.2.5 连接至T载体 82-83 1.2.6 TOP10感受态细胞的制备 83 1.2.7 热激转化与检测 83-84 1.2.8 序列的测定 84 1.2.9 序列比较及系统发育树的构建 84 2 结果与分析 84-89 2.1 PCR扩增 84-85 2.1.1 细菌16S rDNA的PCR扩增 84 2.1.2 酵母菌26S rDNA的PCR扩增 84-85 2.2 序列比较 85-88 2.2.1 酵母菌26S rDNA序列比较 85-87 2.2.2 细菌16S rDNA序列比较 87-88 2.3 基于26S r

16、DNA序列的系统发育树 88-89 第六章 主要结论及几个问题的讨论 89-91 1 重要结论 89 2 创新点 89 3 几个问题的讨论 89-91 参考文献 91-96 致谢 96-97 1.1.3 仪器设备 79 1.2 方法 79-84 1.2.1 增殖培养 79 1.2.2 基因组DNA的提取 79-81 1.2.3 PCR扩增 81-82 1.2.4 回收PCR产物 82 1.2.5 连接至T载体 82-83 1.2.6 TOP10感受态细胞的制备 83 1.2.7 热激转化与检测 83-84 1.2.8 序列的测定 84 1.2.9 序列比较及系统发育树的构建 84 2 结果与分

17、析 84-89 2.1 PCR扩增 84-85 2.1.1 细菌16S rDNA的PCR扩增 84 2.1.2 酵母菌26S rDNA的PCR扩增 84-85 2.2 序列比较 85-88 2.2.1 酵母菌26S rDNA序列比较 85-87 2.2.2 细菌16S rDNA序列比较 87-88 2.3 基于26S rDNA序列的系统发育树 88-89 第六章 主要结论及几个问题的讨论 89-91 1 重要结论 89 2 创新点 89 3 几个问题的讨论 89-91 参考文献 91-96 致谢 96-97 1.1.3 仪器设备 79 1.2 方法 79-84 1.2.1 增殖培养 79 1.

18、2.2 基因组DNA的提取 79-81 1.2.3 PCR扩增 81-82 1.2.4 回收PCR产物 82 1.2.5 连接至T载体 82-83 1.2.6 TOP10感受态细胞的制备 83 1.2.7 热激转化与检测 83-84 1.2.8 序列的测定 84 1.2.9 序列比较及系统发育树的构建 84 2 结果与分析 84-89 2.1 PCR扩增 84-85 2.1.1 细菌16S rDNA的PCR扩增 84 2.1.2 酵母菌26S rDNA的PCR扩增 84-85 2.2 序列比较 85-88 2.2.1 酵母菌26S rDNA序列比较 85-87 2.2.2 细菌16S rDNA

19、序列比较 87-88 2.3 基于26S rDNA序列的系统发育树 88-89 第六章 主要结论及几个问题的讨论 89-91 1 重要结论 89 2 创新点 89 3 几个问题的讨论 89-91 参考文献 91-96 致谢 96-97 1.1.3 仪器设备 79 1.2 方法 79-84 1.2.1 增殖培养 79 1.2.2 基因组DNA的提取 79-81 1.2.3 PCR扩增 81-82 1.2.4 回收PCR产物 82 1.2.5 连接至T载体 82-83 1.2.6 TOP10感受态细胞的制备 83 1.2.7 热激转化与检测 83-84 1.2.8 序列的测定 84 1.2.9 序列比较及系统发育树的构建 84 2 结果与分析 84-89 2.1 PCR扩增 84-85 2.1.1 细菌16S rDNA的PCR扩增 84 2.1.2 酵母菌26S rDNA的PCR扩增