纸层析的实验报告

1、纸层析的实验报吿篇一：纸层析法分离氨基酸实验报告前言纸层析法 纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分 离技术。本世纪初俄国植物学家M. Tswett发现并使用这一技术证明 了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法己成为生 物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是 一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动 相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如 缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适 宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最 后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显

2、色剂或其他 适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离（Rf值）与己知样比较, 进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜 方法定量（如光度法、比色法等）。纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定 氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋口质的氨基酸成分的定性鉴定和 定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生 素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水 是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一 些精度不高的分析，如3, 4-

3、苯并花。但不如GC、HPLC应用普遍。 在做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液 体与层析液(石油瞇)混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在 层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种 色素的相对含量和种类。纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包 括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b,它们在层析液中的溶解 度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢；含量较 多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析 法能清楚地将叶绿体中的色素分离。氨基酸氨基酸是构成蛋白质的基木单位，广泛用于食品、医 药、添加剂及化妆品行业。随着

4、生物工程技术产业的发展逐渐成为 21世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更 越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100 万吨，而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起，氨基酸的 应用在食品工业占61%,在饮料工业占30%,医药、日用化工、农 业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方而占用的比例逐年增加。氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用：(1) 在食品行业的应用(2) 在医药工业的应用(3) 在饲料添加剂行业的应用(4) 在化妆品行业的应用(5) 在农业上的应用(6) 在其他行业的应用氨基酸工业还有着广阔的发展前景：(1) 传统的氨基酸生产方法(2

5、) 运用基因工程手段生产氨基酸(3) 大力发展药用中间体，具体为： 氨基酸及其衍生物逐渐成为药用中间体 非天然氨基酸是合成活性药物的重要原料 生产高附加值的非天然氨基酸一、实验目的(1) 掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术(包 括点样、平衡、展层、显色)。(2) 学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的 方法。二、实验原理(1) 纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的 疑基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有 机相流过固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。(2) 溶质在滤纸上的移动速度用比移值Rf值表示。(3) Rf二原点到层析斑点中

6、心的距离/原点到溶剂前沿的距离。(4) 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与 物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有 关。木实验利用纸层析法分离氨基酸。材料与方法三、实验装置与试剂(1) 氨基酸标准液(lmg/ml)亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。(2) 80%甲醇(3) 0. 1%前三酮丙酮溶液(4) 氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL)(5) 正丁醇实验仪器(1) 新华滤纸XI培养皿XI(3) 电热鼓风干燥箱XI(4) 吹风机XI(5) 毛细管X 4(6) 针、线、尺XI(7) 钟罩(高约430mm,直径约290mm,具磨口塞)X1实验操作(1)

7、滤纸选用国产新华1号滤纸，6cmX7cm0在距滤纸2cm处划线，铅笔在线上标上四个点作为点样位子（留出缝线空间）。（2）点样点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不 清。用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中 心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.5cm之内，点样 过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用 吹风机吹干，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，影响定量结 果。将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线 处纸的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快 而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。（3）展层将揉

8、成圆筒状的滤纸放入培养IIIL内（注意滤纸不要碰皿壁）， 当溶剂展层至距离纸的上沿约lcm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶 剂前沿位置。酸溶剂系统：正丁醇：80%甲酸：水二15:3:2（体积比），苗三酮2nd。温度 25°C,时间 lh。注意：使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。（4）显色待展层基木结束后，置65°C鼓风箱中10-20min,鼓风保温， 滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。（5）Rf值的计算篇二：氨基酸的薄层层析实验报告实验六纸层析法观察转氨基作用【实验名称】：纸层析法观察转氨基作用09救援一班第三大组李岚宇20xx222336室温：28°（一）实验目的：

9、1、学习氨基酸纸层析的基本原理。2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。（二）实验原理：转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的 催化下，氨基酸的a-酮酸与a-酮基的互换反应称为转氨基作用。 转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重 要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的 一氨基转移到另一 a 一酮基酸上。各种转氨酶的活性不同，其中肝 脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化如下反应：« 酮戊二酸+丙氨酸谷氨酸+丙酮酸本实验以丙氨酸和a-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用 纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。纸层析属于分配层 析。以滤纸

10、为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤 维素的纤维之间形成固定相。有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加 到滤纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相 的移动进行连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异，而使 移动速度就不一样，在固定相中，分配趋势较大的组分，随流动相移 动的速度就慢，反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快， 最终不同的组分彼此分离，物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表 示：ALT物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值Rf也相对稳定，因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。（三）实验材料与仪器：试剂：1、0. 01mol/L p

11、H 7. 4磷酸盐缓冲液。2.0. 2mol/L Na2HP04 溶液 81ml 与 0. 2mol/L NaH2PO4 溶液 19ml 混匀,用蒸镭水稀释20倍。3、0. lmol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0. 891克，先溶于少量0. 01mol/L pH 7. 4磷酸盐缓冲液中，以1. 0 N NaOH仔 细调至pH7. 4 后，加磷酸盐缓冲液至100ml o4、0. lmol/L a 一酮戊二酸称取a 一酮戊二酸1. 461克，先溶 于少量0. 01mol/L pH 7. 4磷酸盐缓冲液中，以1. 0 N NaOH仔细调至 pH 7. 4后，加磷酸盐缓冲液至100ml o5、0. lmo

12、l/L谷氨酸溶液称取谷氨酸0. 735克，先溶于少量0. 01mol/LPH 7. 4磷酸盐缓冲液中，以1. 0 NNaOH仔细调至pH 7. 4后, 加磷酸盐缓冲液至50 mlo6、0. 5%苗三酮溶液称取前三酮0. 5克于100 ml丙酮中溶解。7、层析溶剂：将重蒸过的酚2份和水1份按比例混合后，放 入分液漏斗中，震荡，静置24小时后分层，将下部酚层转移到瓶中 备用。仪器：玻璃匀浆器、10ml试管、培养皿、表而皿、沸水浴锅、 37°C恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗。（四）实验步骤：1、肝匀浆制备：取新鲜动物肝0.5克，剪碎后放入匀浆器，加 入冷0. Olmol

13、/LpH 7. 4磷酸盐缓冲液1. 0 ml,迅速研成匀浆，用上 述缓冲液4.5ml混匀备用。2、酶促反应过程（1）取离心管两支，编号：1 （测定管）、2 （对照管），各加 肝匀浆0. 5mlo把对照管放沸水浴中加热10分钟，取出冷却。（2）各加 0. lmol/L 丙氨酸 0. 5 ml, 0. lmol/L a -酮戊二酸 0. 5 ml, 0. 01mol/L pH 7. 4磷酸盐缓冲液1. 5 ml,摇匀。（3）37°C保温，30分钟后取出，保温完毕。（4）把测定管放沸水浴中煮10分钟，取出后冷却，过滤。3、层析（1）取圆形滤纸一张（直径9cm）放洁白纸上，以圆点为中 心，约

14、1 cm为半径，用铅笔划一圆线作为基线，在线上四等份处标清 四点编号作为点样原点。（2）点样：用四根毛细玻璃管分别进行点样。把丙氨酸液、 谷氨酸液分别点在原点2、4处。把测定液、对照液分别点在原点1、 3处。注意斑点不宜过大（应在直径0.5cm以下）。在第一次点样点 干后，再在原处同样点第2次。（3）层析：先在滤纸圆心处打一小孔（铅笔芯粗细），再取滤 纸一条卷成捻如灯芯状，上端插入滤纸中心孔中，下端剪成须状。（4）把滤纸平放在上述培养皿上，使纸芯下浸入层析液中， 盖上培养皿盖。可见层析液沿纸芯上升到滤纸中心，渐向四周扩散。 当层析液前缘到离滤纸边缘约lcm时，约25分钟，取出滤纸，用银 子小心取下纸芯，放入烘箱中烘干。（5）显色：将上述滤纸平放在培养皿上，滴0.5%苛三酮的 丙酮溶液，使滤纸全部湿润，再放入烘箱干燥，此时可见紫色斑出现, 比较色斑的位置，及色泽深浅，计算Rf值，分析是否发生了转氨基 反应。（五）实验结果