类肝素酶在肿瘤血管发生及转移中的调节功能和临床意义

1、类肝素酶在肿瘤血管发生及转移中的调节功能和临床意义         08-06-10 16:50:00     作者：顾昱 周海波，尹宜发    编辑：studa20【关键词】  类肝素酶；硫酸乙酰肝素；癌症；肿瘤血管发生；肿瘤转移    2类肝素酶结构类肝素酶基因位于人染色体4q21.3，遗传标记D4S4002。该基因表达5kb和1.7kb mRNA。5kb结构包括14个外显子和13个内含子。人

2、类肝素酶cDNA包括一个可编码543个氨基分子量61.2kDa的读码框。只有HPSE基因编码产生的类肝素酶具有活性。活性类肝素酶通过胎盘组织、血小板和多种细胞系细胞纯化，其N端自起始密码子缺乏156个氨基酸,表明类肝素酶多肽存在着一些翻译后的蛋白水解形态。随后的报道指出，Hpa是在一段肽链(Ser110Gln157)被水解切割后,形成由一个50kd 亚基(Lys158Ile543)和一个8kd亚基(Gln36Glu109)非共价结合的活性异二聚体,其中8kd亚基对酶活性是必须的3。在预测的氨基酸序列的基础上,人们猜测人Hpa的50kd亚基包含6个假定的N端糖基化作用位点,后经证实这6个位点在培

3、养的细胞中是被糖基化的。糖基化作用并非酶活性所必须,但可调控Hpa的分泌。Hpa还包含一个35氨基酸的N末端信号肽(Met1Ala35)，一个C末端的跨膜结构域(Pro515Ile534)。氨基酸测序结合预测的二级结构表明,Hpa包含与GHA的10 、39 和51家族同源的序列,尤其是在活性位点区域4。这个酶家族水解糖苷键时需要两个关键的残基,一个是质子供体,一个是亲质子供体,两者分别保留于Hpa的Glu225和Glu343处。这些残基的定向诱变导致Hpa活性的完全丧失,表明Hpa有一个裂解HS链的催化结构。    3类肝素酶基因调节  

4、60; 3.1甲基化作用人类肿瘤诱导类肝素酶高表达的相关研究显示，在细胞转录及以后过程的多基因启动区域上有显著的超甲基化区，其对基因转录和癌演化（例如在下调肿瘤抑制因子和DNA修复基因中）产生重大影响。 Shteper等5发现表达类肝素酶活性的肿瘤细胞内至少包涵一个未甲基化的等位基因，相反，未表达类肝素酶活性的细胞则出现完全甲基化的等位基因。向这些未表达类肝素酶活性的细胞注入脱甲基化的等位基因因子，则可以恢复类肝素酶活性，并可以增加活体动物模型的癌转移能力，但仍可以被海带多糖（laminaran sulfate）所抑制。提示类肝素酶活性是肿瘤转移播散的因素。Ogishima等6注意到膀胱、前列

5、腺癌中类肝素酶表达和早期生长因子1（EGF1）的表达水平正相关，EGF1的转录因子牵涉及诱导了类肝素酶基因的转录7。而SP1、Ets等转录因子则与基底的类肝素酶转录水平有关8。    3.2肿瘤抑制基因p53目前对类肝素酶基因转录生理相关抑制物所知甚少。在应用染色质免疫沉淀法（ChIP）分析后，发现野生型p53通过直接结合类肝素酶基因的启动子，抑制其转录，而且此过程涉及到组蛋白脱乙酰基酶化（HDACs）。突变型p53则失去这种抑制能力，某些情况下甚至上调类肝素酶基因的表达9。提示正常状态下类肝素酶基因持续地被野生型p53抑制。癌症发展过程中p53的突变失活，导致类

6、肝素酶转录失控，这可能是肿瘤发生过程中类肝素酶快速增加的机制。    3.3雌激素和乳腺癌当基因甲基化作用在类肝素酶转录调控中起主导作用时，其他调节机制可能开始在局部或全身发挥作用。乳腺癌发生中，雌激素可能就扮演这样一个全身性调节作用，Elkins等10证实雌激素对类肝素酶启动因子的影响，证明其功能的实现是通过一个来源于肝素酶启动因子的荧光素酶的报告基因（luciferase reporter gene）。通过ChIP分析法，发现了雌激素受体（ER）与类肝素酶启动子有着某种联系。在雌激素受体阳性MCF7乳腺癌细胞中荧光素酶的活性和类肝素酶mRNA水平均显著升高，但

7、在经过雌激素处理后受体阴性的乳腺癌细胞中并不存在这种情况，提示可以通过雌激素抑制剂ICI 182,780达到保护的目的10，同时表明类肝素酶在早期乳腺癌肿块生长和新生血管的发生起着重要作用。    3.4炎症介质Edovitsky等11在小鼠迟发型超敏反应模型上，应用类肝素酶免疫染色，发现在致敏的小鼠腹部浸润炎症介质的肉芽肿中，内皮细胞是类肝素酶的主要来源。而且TNF、IFN这些迟发型超敏反应的炎症介质可以上调类肝素酶基因表达及酶的活性。Sotnikov12和Chen13也证实T淋巴细胞、TNF可以诱导类肝素酶表达和分泌。Edovitsky还发现类肝素酶基因1.9

8、kb启动子序列与特异性干扰素激活转录因子（interferonstimulated response elements  ISREs）具有两两同源性。作为类肝素酶活性重要来源的血管内皮细胞对血管基底膜的重塑具有显著意义，并可以增加血管通透性。    4类肝素酶与肿瘤演变    4.1血管生成前过程HSPGs是影响血管形成最重要的成分之一，其降解酶涉及血管发生相关的所有过程。血管发生过程的早期关键就是内皮下基底膜的降解，其紧随于血管刺激后内皮细胞的迁徙。肿瘤细胞的播散与之类似，BM中HS降解后，类肝素酶可能直接促进EC的侵袭和

9、萌芽。Elkins14应用RTPCR及免疫组织化学技术检测到肿瘤样本的毛细血管组织中高表达Hpa，而发育成熟的血管则没有。而且依靠从ECM释放的HS绑定的血管生长因子（如bFGF，VEGF），Hpa可以间接促进EC的迁徙和增殖，并与这些生物活性介质协同促进新生血管形成，同时裂解的HS碎片还能刺激bFGF或其他可能的前血管因子的分裂活性14。Hpa还能从细胞表面释放生长因子HS糖类复合物。Zcharia15发现Hpa促进伤口愈合是通过增加角质化细胞地迁徙、增殖和刺激伤口血管生成、成熟来完成的，同时HS结合的多种生长因子（如bFGF、VEGF、HEEGF和KGF）也参与血管形成和创伤的修复。因此H

10、pa转基因小鼠表现出乳腺管的过度增宽、腺管分支增多及毛发生长加速等现象，这些症状都伴随血管化作用。    4.2与血管发生、细胞寿命和迁徙相关的非酶性功能活性位点点突变（Glu225,Glu343)时，Hpa失去酶活性，但发现其表现出非酶活性的功能，其并不依赖于ECM的降解，细胞外微环境的变化。细胞表面表达无酶活性Hpa使细胞牢固连接，反映其在细胞与ECM间相互连接上的重要作用16。类肝素酶增加Akt信号的传导、刺激PI3K和p38依赖的内皮细胞的迁徙性和侵袭性17。还能促进经由Src通路的VEGF表达18。目前还没有资料阐明Hpa分子非酶性活力的蛋白相应区域，也

11、没有任何推断的Hpa受体表现出能介导这些效应。Joyce19近来在RIPTag2肿瘤模型上发现给予高水平的Hpa mRNA和蛋白后， 肿瘤细胞进一步增殖， 成为肉眼可见的瘤体。 该研究表明， Hpa不仅推进肿瘤转移， 而且成为血管生成的开关， 对肿瘤的生长意义重大。 Cohen等20通过抗血小板内皮细胞粘附分子（antiPECAM1）抗体染色和MRI分析发现肿瘤演变与血管密度增加有关。 分子水平上， Hpa过表达促进细胞黏附及肿瘤细胞、 早期EC和T淋巴细胞迁移。 Hpa在U87神经胶质瘤细胞过表达， 与增强了的Akt/PKB磷酸化水平相关， 在早期EC给予外源性Hpa亦可刺激Akt磷酸化。

12、同样， 其能增加PI3激酶依赖的EC的迁徙和侵袭力， 对EC再塑型成为中空管状结构影响巨大， Hpa对Akt的影响提示其可能减少肿瘤细胞凋亡。 在鼠C6神经胶质瘤、MDAMB435人乳腺癌和人胚胎肾HEK293细胞系中，转染和过表达Hpa，都伴有36成VEGF mRNA和蛋白水平的增加12。而且高转移性鼠B16BL6黑色素瘤细胞系转染了特异HpasiRNA后，Hpa mRNA和VEGF水平下降了75，提示内源性Hpa与VEGF基因调节密切相关，其增加了p38磷酸化水平，该信号途径与VEGF诱导有关,但是对p38的抑制并没影响到Hpa介导的VEGF上调调节，说明其还有其他的信号途径12。对Src

13、通路的抑制，阻滞了Hpa诱导的VEGF表达，明显减慢了由Hpa诱导的细胞迁徙，提示Src也是介导Hpa功能的一个关键下游因素。因此，Hpa可通过酶活性依赖（如bFGF）和非依赖（如VEGF诱导）来发挥功能。其影响肿瘤演变过程中几个关键性成分，导致血管密度增加、诱导血管成熟、促使肿瘤细胞移动，增强了细胞增殖的信号介质的活性并避免细胞凋亡。所以，这些功能使之成为癌症治疗的极具吸引力的分子靶点。    4.3Hpa在转移前过程中的作用肿瘤细胞Hpa活性最初是在B16黑色素瘤细胞中发现的，Hpa活性与小鼠B16黑色素瘤细胞的转移密切相关，高转移倾向的细胞系比低或无转移倾向

14、细胞具有更高的Hpa活性。Hulett等21发现高转移倾向的鼠乳腺癌细胞（13762MAT,DMBA8A）比无转移倾向对照细胞表现出更高的Hpa mRNA转录。Yang等22在骨髓瘤细胞模型上Hpa显著性高表达，诱导多器官自发转移。其在皮下注射的骨髓瘤细胞转移到脾脏、肝脏、肺、骨，而骨内注射则只选择性地在骨组织中播散。在SCID小鼠灌注Hpa转染的MDA231人乳腺癌细胞，发现乳腺脂肪垫内转移，但未发现骨内转移。表明肿瘤细胞表达的Hpa可能发挥着全身性效应。但是在U87人神经胶质瘤细胞系中，发现极度升高的Hpa水平却引起增殖率、播散率下降，紧密的单细胞层降解。因此适量Hpa水平可以显著肿瘤增长，而过量的表达则起到抑制生长的作用，考虑HS在生长因子信号传导中的重要作用，这种效应可能是由于细胞表面HS水平不足所致。依靠这种表达水平依赖性功