猪圆环病毒病2型灭活疫苗(LG株)工艺规程

1、编号编号: SC-TS-02-218猪圆环病毒猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（型灭活疫苗（LG 株）株）工艺规程工艺规程上海海利生物药品有限公司上海海利生物药品有限公司上海海利生物药品有限公司上海海利生物药品有限公司工艺规程生产管理编号: SC-TS-02-218生效日: 1 / 16 页标题: 猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）工艺规程起草 :起草日期 :部门审核 :审核日期 :QA 审核 :审核日期 :批准 :批准日期 :分发部门 : 质管部、技术研发部、生产部目目 录录1. 主题内容主题内容.22. 适用范围适用范围.23. 引用标准引用标准.24. 规程内容规程内容.24.1 品名 .

2、24.2 剂型. 24.3 规格. 24.4 菌（毒）种.24.5 批准文号.24.6 工艺流程图.24.7 质量控制点.44.8 活性物质制备工艺过程.44.9 活性物质生产技术经济指标和原料利用率计算.74.10 油乳剂灭活疫苗制造工艺过程.74.11 油乳剂剂制造技术经济指标.94.12 设备一览表.104.13 生物安全及劳动保护.104.14 物料 .114.15 成品质量标准.134.16 贮藏和有效期.144.17 包装材料要求.144.18 标签、说明书.15题目 :猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）工艺规程编号: SC-TS-02-218 2 / 16 页1. 主题内容主

3、题内容本标准规定猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）达到的技术要求。2. 适用范围适用范围本标准适用于猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）3. 引用标准引用标准国家标准(猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）制造及检验试行规程)。4. 规程内容规程内容4.1 品名品名通用名称：猪圆环病毒 2 型灭活疫苗(LG 株)英 文 名：Porcine Circovirus Type 2 Vaccine,Inacitvated（Strain LG）汉语拼音：Zhu Yuanhuanbingdu Erxing Miehuoyimiao(LG Zhu)4.2 剂型剂型水包油剂型4.3 规格规格20ml/瓶

4、、40 ml/瓶、100ml/瓶、250 ml/瓶4.4 菌（毒）种菌（毒）种1.来源：中国农业科学院哈尔滨兽医生物研究所保存2.毒株：猪圆环病毒 LG 株3.代次：5660 代4.保存温度：-80以下以下保存4.5 批准文号批准文号兽药生字（2010）0902010714.6 工艺流程图工艺流程图转瓶制备成细胞悬液同步接种毒收获生产用 PK-15 细胞弃液并加入胰蛋白酶，消化细胞加入 DMEM 液，分散细胞分装，取样检测猪圆环病毒猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（型灭活疫苗（LG 株）工艺流程图株）工艺流程图3648h，换维持液细胞病变达 7080%转瓶培养反复冻融 3 次乳化*轧 盖贴 签入 库

5、成品检验半成品检测标 签说明书、纸箱合格抗原灭活灭活检验*分 装装 箱百级区万级区带项为质量控制点十万级区题目 :猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）工艺规程编号: SC-TS-02-218 4 / 16 页4.7 质量控制点质量控制点工序名称控制项目控制标准消化液0.125%胰蛋白酶+0.01EDTA 溶液；50-100mL/转瓶消化温度37细胞消化消化时间转动转瓶，待细胞层开始出现裂缝时终止，一般为 45 秒温度37恒温室的控制时间细胞生长成单层即可结束培养，一般为 24 小时左右转瓶培养转速转瓶机设置为 1012 转/小时接种量无菌控制下接种，5%接 毒无菌检测取样，T.G、G.P、G

6、.A 培养基培养应无菌调 PH 值PH 值2 日后，无菌，7.5%碳酸氢钠调 PH 为 7.2观 察细胞病变情况出现混浊，可能污染，弃去。细胞病变达 70%80%时收获 收 获无菌无菌控制下操作，不污染灭活剂0.2%的甲醛灭活温度调整灭活罐的温度为 37灭 活灭活时间灭活充分，维持 24 小时水相、油相比例保证抗原含量并不分层，水相：油相为 9:1乳化时间30 分钟乳 化乳化温度0104.8 活性物质制备工艺过程活性物质制备工艺过程4.8.1 PK-15细胞系标准：1.细胞形态：用含 10%的小牛血清的 MEM 培养液培养细胞，置 37、含 5%CO2 培养箱中培养， 23 小时可貼壁，培养

7、48 小时应在 1/2 以上的瓶面出现细胞岛，并有部分相连、镜检时细胞形态是椭圆形或梭状上皮细胞，明朗、轮廓清晰、胞浆内可见小颗粒，7296 小时形成单层。2.细胞纯净性：应无菌、无霉菌、无支原体、无外源病毒污染。3.细胞致瘤性检验：不致瘤。4.细胞核学检查：不同代次的细胞与基础细胞库的细胞相比，所有细胞的染色体模式数不得高出15%，核型必须相同。5.制苗的细胞代次：第 2040 代之间。6.细胞保存：液氮保存，保存期为 36 个月。4.8.2生产用毒种要求病毒含量：每毫升病毒含量应不低于 105.5TCID50纯净性：病毒应无题目 :猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）工艺规程编号: SC

8、-TS-02-218 5 / 16 页细菌霉菌支原体其它外源病毒特异性 与 PCV2 阳性血清中和后接种 PK15 细胞，中和细胞孔 IPMA 检测无明显着色反应，病毒对照孔呈棕红色染色。毒种保存与毒种继代1）在-20以下保存，应不超过 1 年。 2）继代应不超过 3 代。4.8.3 细胞的传代工艺过程 选生长 23 天已形成致密单层的细胞种按常规法进行细胞分散， 37培养，23 天传代一次。传代细胞传代时的分种率一般 1：3 即 1 瓶分 3 瓶，也可 1：5。可根据生产和试验的需要和细胞生长的情况增殖和扩大细胞。每次传代应在细胞瓶上（中方瓶、扁瓶、圆瓶）注明细胞代次、日期。生长不良、形态不

9、好的细胞不能用。生长不良、形态不好的细胞不能用。工作条件洁净级别：100 级温度：1826相对湿度：3065%工作环境压差：大于 5Pa工作器械121高温灭菌高温蒸汽灭菌工艺应进行验证高温蒸汽灭菌工艺应进行验证4.8.4接种制备细胞同步接种 5%LG 毒种，置 37温室的转瓶机上培养，转速 1012 转/小时。 4.8.5观察和收获工艺过程 接种后每天逐瓶观察细胞病变，并做好记录，接毒后 3648 小时用无血清的 MEM 培养基换液 1次，继续培养 7296 小时 收获病毒液，置20以下冰箱冻结保存，保存期不得超过 12 个月。细胞培养物需冻融 3 次，检验无菌后，将数瓶圆瓶的病毒液混合后，无

10、菌吸取病毒液小样，进行中间检验。题目 :猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）工艺规程编号: SC-TS-02-218 6 / 16 页工作条件洁净级别：100 级温度：1826相对湿度：3065%工作环境压差：大于 5Pa工作器械121高温灭菌高温蒸汽灭菌工艺应进行验证高温蒸汽灭菌工艺应进行验证4.8.6. 灭活工艺过程工艺过程病毒液导入灭活罐后， 将甲醛溶液缓缓导入灭活罐使其终浓度为 0.2%，37灭活 24 小时。灭活结束后用 10%亚硫酸钠加入病毒液，使其终浓度为0.05%终止灭活。工作环境洁净级别：10000 级温度：1826相对湿度：3065%工作条件压差：大于 5Pa工作器械12

11、1高温灭菌高温蒸汽灭菌工艺应进行验证高温蒸汽灭菌工艺应进行验证4.8.7半成品检验 4.8.7.1 按照现行中国兽药典附录进行检验，应无细菌霉菌支原体外源病毒 4.8.7.2 病毒含量检验IPMA(免疫过氧化物酶单层细胞染色法)1)将毒种用无血清 MEM 培养基做 10 倍系列稀释。2)取10-3、10-4、10-5、10-6 4个稀释度各接种96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，每孔100UL,同时设不接毒的空白对照4孔；3)每孔再加入100uL加入新消化的PK15细胞悬液4)37、含5%CO2培养箱中培养72小时5)用33%丙酮-PBS固定，用PCV2阳性血清进行IPMA试验，测定各孔中病

12、毒感染情况，按照Reed-Muench法计算TCID50，每ml病毒含量应不低于105.5TCID50。4.8.7.3 抗原灭活检验后检验按现行中国兽药典附录进行检验，应无菌灭活检验 灭活后的病毒液10倍稀释后取10-1、10-2、10-3 3个稀释度，每个稀释度各取1ml接种到新消化的PK15细胞培养瓶中， 37、含5%CO2培养箱中培养96小时，盲传2代，按照病毒含量检验法检验，应均为阴性结果。4.8.8岗位定员和生产周期岗位人员生产周期制细胞3配液2接种2收获3每批共每批共 7 天天4.8.9原材料：PK15 细胞，其质量标准应符合 PK15 细胞系的要求。4.9 活性物质生产技术经济指

13、标和原料利用率计算活性物质生产技术经济指标和原料利用率计算原料营养液收获得益率数量PK-15 细胞10*100095%价值/元50010*1000*0.21000*10*0.95每 ml 活性物质（500+2000）/1000*10*0.95=0.2631 元4.10 油乳剂灭活疫苗制造工艺过程油乳剂灭活疫苗制造工艺过程4.10.1配方灭活液水相9 份15 A VG油相1 份4.10.2 油相制备 为法国 SEPPIC 提供的 MontanideTMISA 15A VG 佐剂，题目 :猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）工艺规程编号: SC-TS-02-218 7 / 16 页4.10.3水

14、相制备 为已灭活的病毒液4.10.4乳化 按照上述比例，先将水相加之乳化容器中进行搅拌，然后缓慢加入油相，以 800r/min 搅拌 30 分钟，再静止 30 分钟。4.10.5分装4.10.5.1内包装容器 名称：西林瓶或药用高密度聚乙烯瓶、丁腈橡胶塞药用高密度聚乙烯瓶由符合 GMP 要求的厂家直接提供。丁腈橡胶塞灭菌：121，蒸汽灭菌 20 分钟。西林瓶清洗：用超声波清洗机清洗 2-3 次；121，干热灭菌 60 分钟。4.10.5.2分装生产：生产好的疫苗产品，移至分装生产线上，进行分装，有 20ml/瓶、40 ml/瓶、100ml/瓶、250 ml/瓶四种规格。 4.10.5.3 工作

15、环境洁净级别：100 级温度：1826相对湿度：3065%工作条件压差：大于 5Pa工作器械121高温灭菌高温蒸汽灭菌工艺应进行验证高温蒸汽灭菌工艺应进行验证4.10.6轧盖贴签装箱压盖：分装完毕的产品，立即进入压盖生产线，加上铝盖，进行压盖。贴签：贴签机调整设置好相应的产品批号及有效期限，进入贴签程序。装盒：20ml 每 10 瓶一盒，盒内放置说明书，用条形码封小盒口；装箱。100ml 每一瓶装入纸箱，盒内放置说明书，再每 10 瓶装入一盒；用条形码封小盒口。装箱：外箱用泡沫箱外套纸箱，20ml 每箱放入 49 盒疫苗，并在包装箱外侧贴一张该产品的标签。100ml 每箱放入 9 盒疫苗，并在

16、包装箱外侧贴一张该产品的标签。入库。注：批号设置、贴签印刷应符合注：批号设置、贴签印刷应符合兽药瓶签、说明书的管理规定兽药瓶签、说明书的管理规定题目 :猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）工艺规程编号: SC-TS-02-218 8 / 16 页4.10.7岗位定员和生产周期岗位人员生产周期分装41/2 天压盖31/2 天贴签装箱32 天4.11 油乳剂剂制造技术经济指标油乳剂剂制造技术经济指标序号项 目 及 计 算指 标1分装率（%）=实际分装瓶数/理论分装瓶数*100%100%5%2合格率（%）=合格瓶数/实际分装瓶数*100%99%题目 :猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）工艺规程

17、编号: SC-TS-02-218 9 / 16 页题目 :猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）工艺规程编号: SC-TS-02-218 10 / 16 页4.12 设备一览表设备一览表编号工序设 备 名 称型 号规格数量制 造 单 位1恒温培养箱HW-25000-1002上海一恒科学仪器有限公司2恒温摇床YC-1200-651上海一恒科学仪器有限公司3转瓶机SHXJ-VI1400*650*140004南京博健科技有限公司4-70冰箱HAIER450L1青岛海尔集团52-8冷库装配40m22上海开灵制冷有限公司6-20冰库装配20m21上海开灵制冷有限公司7脉动真空灭菌柜YXQ-MG-2252

18、200*2000*22001华菱医疗设备制造有限公司8脉动真空灭菌柜YXQ-MG-2082415*1200*18001华菱医疗设备制造有限公司11活性成分制备干热灭菌柜101A1600*1800*25501华菱医疗设备制造有限公司12灭活罐YJ-20052000L4上海永巨制药设备有限公司13灭活电子天平YH-10000.00011上海一恒科技有限公司14乳化乳化泵RH-20002000L3上海华东制药机械有限公司15分装机HD-20050-20ml1上海华东制药机械有限公司16分装机HD-20050-100ml1上海华东制药机械有限公司17自动胶塞清洗机CDDA-102370*1320*18

19、801上海欣丽实业有限公司18分装臭氧灭菌柜KER-10001600*1800*5501康尔医药设备制造有限公司19轧盖机XF-20051375*755*16001上海华东制药机械有限公司20包装贴签机TLJ1650*845*12001上海华东制药机械有限公司21检验恒温箱HIHENG650*445*5501上海一恒科技有限公司4.13 生物安全及劳动保护生物安全及劳动保护4.13.1技术安全1.上岗工人必须经过“生物安全及自我防护”培训。2.生产过程中，各岗位必须严格按照工艺规程、岗位标准操作程序及设备标准操作程序操作，不得违反。3.生产时必须在符合兽药 GMP 要求环境条件下进行。4.每次

20、生产更换批号（或品种和规格），各工序须清洗工具容器和场地，达到清场要求。5.各工序半成品容器加盖密封存放，放至半成品贮存间规定的地方，防止异物混入，并有明显标志（有卡片），按品名、规格、批号存放或设棚栏隔开。6.机器设备有专人管理、维护、保养。严格执行安全用电规定，经常检查电源、线路，防止漏电短路，电源要接地线，禁止湿手开掣；机电设备严禁带病运转，机器运行时，严禁用手伸入转动部位；禁止用水洗电机转轴及皮带轮防护安全罩，操作时不能站在与皮带轮同一线上。7.随时检查燃气系统，应保持完好无损，以免发生事故，设备、设施应定期检查完好情况。8.管道标志明显：水管涂绿色，药液管涂黄色，蒸气管涂红色，严防漏

21、气漏液。高压容器、管道系统等应经劳动技术安全部门检测合格方能使用。9.各工序均应配备防火设施和其他意外应急设施，每个员工都要学会使用灭火器材。10. 各岗位操作人员须经严格岗位培训并经考核合格，凭岗位合格证才能上岗独立操作。非本岗位人员不能顶替上班。当班人员不能随意离开岗位，严禁窜岗，必需离开时要有本岗位人员接替方能离开。交接班应交接清楚，认真填写交接班记录。11. 各岗位上岗须按规定穿戴工作服、帽、鞋、手套。特别是接触强酸、强碱，要穿戴防护衣、胶手套、水鞋及防护镜，避免酸、碱液溅到身上。万一被溅上皮肤，立即用大量水冲洗。 4.13.2劳动保护1上班人员均要按规定穿戴工作服、帽、鞋、防护手套等

22、劳保用品。2使用显微镜的人员严格执行中休、班休制度，每年检查视力一次。员工每年进行健康检查一次。建立健康档案。员工每年进行健康检查一次。建立健康档案。4.14 物料物料4.14.1 注射用水的质量标准及检验1）性状：本品为纯化水经蒸馏所得的无色的澄明液体；无臭，无味。2）检查 a :pH 值 :应为 5.07.0（附录 H）。b :氨 取本品 50ml，照纯化水的方法检查，注：对照用氯化铵溶液改为注：对照用氯化铵溶液改为 1.0ml，应符合规定（0.00002）。c :细菌内毒素 取本品，依法检查（附录 E），每 1ml 中含内毒素量应小于 0.25EU。d :氯化物、硫酸盐与钙盐、硝酸盐与亚

23、硝酸盐、二氧化碳、易氧化物、不挥发物与重金属照纯化水的方法检查，应符合规定。 题目 :猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）工艺规程编号: SC-TS-02-218 11 / 16 页题目 :猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）工艺规程编号: SC-TS-02-218 12 / 16 页4.14.2小牛血清名称： 牛血清质量标准：2005 年版中华人民共和国药典三部附录供应商： 上海微科生化试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）4.14.3营养液名称：MEM质量标准： HG/T 3935-2007供应商：清大天一生物科技有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）4.14.4磷酸钠

24、名称：磷酸钠质量标准：HG/T2968-1999供应商：国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）4.14.5磷酸氢二钾名称：磷酸氢二钾质量标准：HG-T3487-2000供应商：国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）4.14.6磷酸氢二钠名称：磷酸氢二钠质量标准：GB 12632006供应商：国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）4.14.7 胰酶名称：胰酶 质量标准：GB/T 21498-2008供应商：国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）4.14.8 D-氨基葡萄糖名称：D-氨基葡萄糖供应商： Sigm

25、a（或经公司批准的其他符合规定的厂家）题目 :猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）工艺规程编号: SC-TS-02-218 13 / 16 页4.14.9无水氯化钙名称：无水氯化钙质量标准：HG/T2327-92供应商：国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）4.14.10苯酚红名称：苯酚红质量标准：GB/T 15351-94供应商：国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）4.14.11佐剂名称：15A VG 佐剂质量标准：供应商：法国 SEPPIC 公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）4.14.12 EDTA名称：乙二胺四乙酸二钠(250g)质量

26、标准：GB12593-2007供应商： 国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）4.14.13 乙醇名称：乙醇质量标准：中国药典，2000 年版。供应商：国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）4.15成品质量标准成品质量标准4.15.1 物理性状外观 本品为粉白色乳状液。剂型 水包油型。稳定性 取疫苗 10ml 加入离心管中，以 3000r/min 离心 30 分钟，管底析出的水相应不大于0.5ml。粘度 用 1ml 吸管（出口内径 1.2mm），吸取 25左右的疫苗 1ml，令其垂直自然流下，记录流出0.4ml 所需的时间，应在 4 秒以内。4.15

27、.2 无菌检验 应无菌生长。4.15.3 安全检验用 3040 日龄健康易感仔猪（IPMA 法检测 PCV2 抗体效价，应低于 50）5 头。各深部肌肉注射疫苗 2ml。连续观察 14 日。接种前 1 日及接种后逐日测定体温，每日上、下午各测定 1 次。应不出现体温升高，或仅于接种次日体温升高不超过 1，在观察期内应不出现由疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应。4.15.4 效力检验下列方法任择其一。（1） 抗体检测 用 3040 日龄健康易感仔猪（IPMA 法检测 PCV2 抗体，应低于 50，见附注1）10 头，随机等分成 2 组。其中一组分别经颈部肌肉注射途径接种疫苗 1ml，21 日后

28、，以相同剂量和途径加强免疫 1 次；另一组不接种疫苗，作为对照组。二免后 14 日采集血，分离血清，用 IPMA法（见附注 1）检测血清抗体效价。免疫猪应至少 4 头抗体效价不低于 800，对照猪抗体效价均应低于 50。（2） 免疫攻毒 二免后 14 日，取上述免疫猪和对照猪，用 PCV2 LG 株强毒攻击，通过滴鼻和肌肉注射途径各接种 1ml（105.0 TCID50）。称取攻毒当日体重。攻毒后 28 日，将所有猪称重后扑杀，取腹股沟淋巴结样品，采用荧光定量 PCR 法（见附注 2）检测病毒核酸载量。相对增重率（见附注3）应不低于 5%；免疫猪应至少 4 头病毒核酸载量不高于 3.5107拷

29、贝/g 组织，对照猪应至少 4 头病毒核酸载量不低于 1.45109拷贝/g 组织。4.15.5 甲醛含量测定应不超过 0.2%。4.16 贮藏和有效期贮藏和有效期2-8保存，18 个月4.17 包装材料要求包装材料要求4.17.1标签名称：猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）标签质量标准：80 克铜板纸，内容符合兽药瓶签、说明书的管理规定兽药瓶签、说明书的管理规定尺寸：24mm60mm，39mm98mm供应商：上海郑盛印务有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）4.17.2塑料瓶名称：外用液体药用高密度聚乙烯瓶质量标准：符合中华人民共和国药品管理法和药品包装用材料和容器管理办法尺寸：20mm供应商：沧州维康食品药品包装有限公司，江阴恒利源包装材料有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）题目 :猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）工艺规程编号: SC-TS-02-218 14 / 16 页