大量提取质粒 DNA(CsCl 密度梯度离心法)_第1页
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文档简介

1、大量提取质粒DNA(CsCl密度梯度离心法李渊越1.预约摇床、超速离心机。2.配TB培养基(1L锥形瓶中装250 ml培养液,并灭菌。质粒做好转化,并涂板。 。、。17.超离后,取样品,用5 ml注射器加上12#针头,抽取EB带,(离心完可见两条EB带,上面一条细浅的带为断裂的质粒DNA,应抽取下面一条粗浓的EB带放入50ml管中。18.以灭菌水饱和正丁醇溶液萃取EB,直到溶液澄清无色。19.加入等体积TE(一定要加。若不加,在无水乙醇沉淀时,会沉淀下部分CsCl。20.加入2倍体积预冷的无水乙醇,混匀(如果不充分混匀,可能会导致离下的DNA是透明的,容易随上清一起倒掉。6,000rpm,20

2、min,(注意方向去上清(注意沉淀不会贴壁,不要倒掉。21.加入450 µl (900ul水,把50mL离心管平放(注意方向,溶解,直到溶解完全(约需室温过夜。22.用枪小心将液体吸入1.5mL离心管中(如>450ul,可分成两管,加入十分之一体积的3 M NaAc (pH5.2,再加入2倍体积预冷的无水乙醇,混匀,置于4C或-20C 15-30min。13,000 rpm 离心10min。23.用1mL 70%预冷的乙醇洗沉淀一次,13,000rpm 离心10min。24.去上清,以1mL TE溶解完全,测定浓度。lysozyme-EDTA-RNase溶液溶菌酶0.4 g0.

3、5M EDTA (pH=8.0 25mLRNase A (100mg/mL 120uLH2O 25mL25%蔗糖:蔗糖25 g1 M Tris-HCl(pH 8.0 5 ml过滤,加纯水定容至100 ml,置于4 保存。0.5 M EDTA(pH 8.0:gNaOH 约20 g加800 ml纯水溶解完全后,调pH至8.0,定容至1 L,湿热灭菌,常温保存。Triton-lysis:10% Triton-100 5mL1 M Tris-HCl(pH 8.0 15 mLH2O 100mL湿热灭菌,常温保存。PEG8000:PEG8000 150 g5 M NaCl 150 ml加纯水定容至500

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